Un análisis del flujo de calcio de alto rendimiento para el estudio de los receptores NMDA con sensibilidad D/glicina-serina y glutamato
Summary
El objetivo de este protocolo es facilitar el estudio de receptores de NMDA (NMDAR) a una escala mayor y permitir el examen de los efectos moduladores de pequeñas moléculas y sus aplicaciones terapéuticas.
Abstract
Los receptores N-metil-D-Aspartato (NMDA) (NMDAR) se clasifican como receptores de glutamato ionotrópicos y tienen un papel crítico en el aprendizaje y la memoria. Mal funcionamiento NMDAR, expresado como sea sobre – o debajo – activity causada por mutaciones, expresión alterada, tráfico y localización, puede contribuir a numerosas enfermedades, especialmente en el sistema nervioso central. Por lo tanto, entender la biología del receptor, así como facilitar el descubrimiento de compuestos y moléculas pequeñas es crucial en los esfuerzos para combatir enfermedades neurológicas. Enfoques actuales del estudio de los receptores tienen limitaciones como bajo rendimiento, alto costo y la incapacidad para el estudio de sus capacidades funcionales debido a la necesaria presencia de bloqueadores de los canales para evitar la excitotoxicidad mediada de NMDAR. Además, los sistemas de análisis existentes son sensibles a la estimulación por el glutamato solo y carecen de sensibilidad a la estimulación por glicina, otro ligando co del NMDAR. Presentamos el primer ensayo de placa de base con la energía de alto rendimiento para el estudio de un receptor NMDA con sensibilidad a ligandos Co, glutamato y D-serina/glicina. Este enfoque permite el estudio de las diferentes composiciones de subunidad NMDAR y estudios funcionales del receptor en modos sensibles a glutamato y glicina. Además, el método no requiere la presencia de inhibidores durante las mediciones. Los efectos de los moduladores alostéricos positivos y negativos se pueden detectar con este ensayo y la farmacología conocida de NMDAR ha sido replicada en nuestro sistema. Esta técnica supera las limitaciones de los métodos existentes y es económica. Creemos que esta nueva técnica acelerará el descubrimiento de terapias para patologías de NMDAR-mediada.
Introduction
Con los avances actuales en la medicina, la esperanza de vida ha aumentado significativamente; sin embargo, tiene tan la prevalencia de enfermedades relacionadas con la edad. Enfermedades del sistema nervioso central (SNC) tales como esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer y de Parkinson, entre otros, no son la excepción y se han proyectado para aumentar durante el próximo decenio1, 2 , 3. el mal funcionamiento de receptores de glutamato ionotrópicos conocido como receptores N-metil-D-Aspartato (NMDAR) se ha relacionado con la enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, lesión cerebral traumática, accidente cerebrovascular, diabetes y glaucoma entre otros, que garantiza la necesidad de estudiar su biología para el desarrollo de terapias eficaces, modificadores de la enfermedad4,5,6,7.
NMDARs se componen de cuatro monómeros o subunidades4,8,9. La composición estructural de lo NMDAR muestra variabilidad regional y de desarrollo en el cerebro de7,10. NMDARs están implicados en la plasticidad sináptica, la cognición y la generación de los ritmos de respiración y locomoción11,12,13. Como un canal voltaje-bloqueado, es en gran parte no conductoras en el potencial de membrana de reposo (-70 mV) y es bloqueado por magnesio para evitar la penetración de los iones. El canal es activado por la Unión de dos ligandos, glutamato y glicina/D-serina y una simultánea despolarización en la membrana sináptica mediada por receptores AMPA, otra subclase de receptores de glutamato ionotrópicos. La despolarización elimina el bloqueo de magnesio de NMDAR, permitiendo la afluencia de cationes, particularmente calcio14,15,16. A pesar de que la activación de NMDAR es esencial para la supervivencia de la célula, activación excesiva puede conducir a la célula muerte17,18,19 por excitotoxicidad. Esto, además de la compleja naturaleza de los receptores, hace difícil realizar estudios necesarios para el desarrollo de terapias efectivas.
Se han desarrollado diferentes métodos para estudiar el NMDAR. Sin embargo, cada uno tiene acompañamiento de advertencias. Por ejemplo, una técnica ampliamente utilizada es un ensayo basado en la fluorescencia que mide los cambios de NMDAR mediada por calcio intracelular en una línea celular estable bajo el control de un promotor inducible por tetraciclina (Tet-en)20. Sin embargo, en este sistema, las concentraciones de supramaximal de ligandos que se necesitan y el requisito de que los inhibidores de NMDAR están presentes durante la medición es casi imposible detectar la actividad del antagonista competitivo. En otros sistemas similares, la expresión del receptor funcional de causa toxicidad, requiriendo bloqueadores de los canales tales como ketamina21,22 para preservar los cultivos celulares. Estos bloqueadores de los canales se sientan en el corazón del receptor y son difíciles de lavar, sobre todo en un formato basado en la placa, para que interfieran con los estudios funcionales del receptor. Finalmente, en medidas electrofisiológicas como fijación con abrazadera del remiendo, hay limitado rendimiento, y estudios de gran escala son muy caro23. No obstante, los sistemas anteriores son insensibles a la estimulación de la glicina; por lo tanto, estudiando la actividad dependiente de la glicina de la NMDAR se convierte en un reto.
Aquí, describimos un nuevo enfoque para el estudio de NMDAR que supera las limitaciones discutidas. Nuestra técnica aprovecha el sistema de expresión de baculovirus para expresar el receptor a nivel funcional con una relación óptima de las subunidades en tan poco como 16 horas. Además, el uso de baculovirus permite un enfoque simple y combinatorio, que proporciona una caracterización amplia de los distintos subtipos NMDAR recombinantes. A diferencia de otros ensayos, este Protocolo no requiere bloqueadores de los canales por el uso de antagonistas débiles. Ventaja más fuerte del método es que lavado después de la débil antagonista, el receptor es sensible a la modulación de los sitios individuales de glicina y glutamato enlace además de doble modulación de D/glicina-serina y glutamato-ligando sitios. El ensayo recapitula conocido farmacología del receptor NMDAR y los efectos de sus conocidos moduladores positivos y negativos. Finalmente, la generación de este ensayo celular en vitro supera la toxicidad celular causada por la afluencia excesiva de calcio y permite estudios funcionales del receptor de la manera un alto rendimiento, que puede acelerar descubrimientos de moduladores NMDAR en Estados de enfermedad.
Protocol
Representative Results
Discussion
El éxito de este ensayo depende en gran medida la salud de las células HEK. Las células que experimentan un crecimiento exponencial y con número de paso bajo se debe utilizar. Este análisis implica a muchos traslados y adiciones de soluciones, así que con cuidado asegurarán una mayor precisión en sus resultados. Concentraciones de compuestos y otros reactivos deben ser también revisado en cruz para minimizar los errores. Al sustituir los medios de comunicación de la célula con el tampón de ensayo para el aná…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean dar las gracias a la oficina del programa de Post bachillerato académicos e institutos de Novartis para la investigación biomédica en su conjunto para la financiación de este estudio.
Materials
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
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