Een High-throughput Calcium-flux Assay te studeren NMDA-receptoren met gevoeligheid voor Glycine/D-serine en glutamaat
Summary
Het doel van dit protocol is te vergemakkelijken van de studie van NMDA-receptoren (NMDAR) op een grotere schaal en het onderzoek van f effecten van kleine moleculen en hun therapeutische toepassingen.
Abstract
N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptoren (NMDAR) worden geclassificeerd als ionotropic glutamaat receptoren en hebben belangrijke rol bij het leren en geheugen. NMDAR storing, uitgedrukt als ofwel over – of onder – activity veroorzaakt door mutaties, veranderde expressie, mensenhandel of lokalisatie, kan bijdragen aan vele ziekten, met name in het centrale zenuwstelsel. Begrip van de receptor biologie, alsmede het vergemakkelijken van de ontdekking van stoffen en kleine moleculen is daarom van cruciaal belang in voortdurende inspanningen ter bestrijding van neurologische aandoeningen. Huidige aanpak aan het bestuderen van de receptor hebben beperkingen waaronder lage doorvoersnelheid, hoge kosten en het onvermogen om te bestuderen zijn functionele capaciteiten als gevolg van de noodzakelijke aanwezigheid van kanaal blokkers om te voorkomen dat NMDAR-gemedieerde excitotoxicity. Bovendien, de bestaande assay-systemen zijn gevoelig voor stimulatie door glutamaat slechts en gebrek aan gevoeligheid voor stimulatie door glycine, de andere co ligand van de NMDAR. Hier presenteren wij de eerste plaat gebaseerde bepaling met hoge gegevensdoorvoer macht te bestuderen van een NMDA-receptor met gevoeligheid voor zowel mede-liganden, glutamaat en D-serine/glycine. Deze benadering kunt de studie van de verschillende NMDAR subeenheid composities en functionele studies van de receptor in glycine – en/of glutamaat-gevoelige modi. De methode hoeft bovendien niet de aanwezigheid van remmers tijdens de metingen. De effecten van positieve en negatieve allosteric modulatoren met deze test kunnen worden gedetecteerd en de bekende farmacologie van NMDAR is gerepliceerd in ons systeem. Deze techniek overwint de beperkingen van bestaande methoden en rendabel. Wij zijn van mening dat deze nieuwe techniek zal het versnellen van de ontdekking van therapieën voor NMDAR-gemedieerde aandoeningen.
Introduction
Met huidige vooruitgang in de geneeskunde toegenomen levensverwachting aanzienlijk; Zo heeft echter de prevalentie van leeftijd gerelateerde ziekten. Ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS) zoals schizofrenie, Amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Alzheimer en Parkinson’s disease, onder anderen, zijn geen uitzondering en hebben naar zijn verwachting toenemen in de komende tien jaar1, 2 , 3. de storing van ionotropic glutamaat receptoren bekend als N-methyl-D-aspartaat receptoren (NMDAR) is gekoppeld aan de ziekte van Alzheimer, schizofrenie, traumatisch hersenletsel, beroerte, diabetes en glaucoom o.a. die garandeert de moeten hun biologie voor de ontwikkeling van effectieve, ziekte-wijzigen therapieën4,5,6,7te bestuderen.
NMDARs bestaan uit vier monomeren of subeenheden4,8,–9. De structurele samenstelling van de NMDAR toont ontwikkelings- en regionale variabiliteit binnen de hersenen7,10. NMDARs zijn betrokken bij de Synaptische plasticiteit, cognitie en de generatie van ritmes voor ademhaling en motoriek11,12,13. Als een spanning-gated kanaal, het is grotendeels niet-geleidend op rusten membraanpotentiaal (-70 mV) en wordt geblokkeerd door magnesium om te voorkomen dat verdere permeatie van ionen. Het kanaal wordt geactiveerd door de binding van twee liganden, glutamaat en glycine/D-serine en een gelijktijdige depolarisatie op de synaptische membraan gemedieerd door AMPA receptoren, een subklasse van ionotropic glutamaat receptoren. De depolarisatie verwijdert de magnesium-blokkering van de NMDAR, zodat de toestroom van kationen, met name calcium14,15,16. Hoewel de activering van het NMDAR essentieel voor de overleving van de cel is, kan buitensporige activering leiden tot cel dood17,18,19 tot en met excitotoxicity. Dit, maakt naast het complexe karakter van de receptoren, het uitdagend om onderzoek te verrichten nodig voor het ontwikkelen van effectieve therapieën.
Verschillende methoden hebben ontwikkeld om te bestuderen van de NMDAR. Echter, ieder heeft begeleidende waarschuwingen. Bijvoorbeeld, is een veel gebruikte techniek een fluorescentie-gebaseerde test die NMDAR-gemedieerde veranderingen in intracellulair calcium in een stabiele cellijn onder de controle van een tetracycline-afleidbare promotor (Tet-On)20 meet. In dit systeem maakt de supramaximal concentraties van liganden die nodig zijn en de eis dat NMDAR-remmers aanwezig tijdens de meting zijn het echter bijna onmogelijk op te sporen van de activiteit van de concurrerende antagonist. De expressie van de functionele receptor veroorzaakt in andere soortgelijke systemen, toxiciteit, kanaal-blokkers zoals ketamine21,22 te behouden van de celculturen vereisen. Deze kanaal blokkers zitten de kern van de receptor en zijn moeilijk te wassen, met name in een plaat gebaseerde indeling, zodat ze met functionele studies van de receptor interfereren. Ten slotte, in elektrofysiologische metingen zoals patch klemmen, er is beperkte doorvoer en grootschalig onderzoek zijn erg duur23. Ondanks zijn de bovengenoemde systemen ongevoelig voor glycine stimulatie; Vandaar, studeren glycine-afhankelijke activiteit van de NMDAR wordt een uitdaging.
Hier beschrijven we een nieuwe benadering voor de studie van NMDAR dat de besproken beperkingen overwint. Onze techniek speelt in op het systeem van de expressie baculovirus wil de receptor op functionele niveaus met een optimale verhouding van de subeenheden in zo weinig als 16 uur. Anderzijds zorgt het gebruik van baculovirus voor een eenvoudige en combinatorische aanpak, waarmee een globale karakterisering van de verschillende subtypen voor recombinante NMDAR. In tegenstelling tot andere testen vereist dit protocol geen kanaal blokkers vanwege het gebruik van zwakke antagonisten. De sterkste voordeel van de methode is dat na wassen van de zwakke antagonist, de receptor is gevoelig voor modulatie van de individuele glycine – en glutamaat-bandplaatsen naast dual modulatie van zowel glutamaat als glycine/D-serine ligand-bindende sites. De assay recapituleert bekende farmacologie van de NMDAR receptor en de gevolgen van haar bekende positieve en negatieve modulatoren. Ten slotte, deze cellulaire assay in vitro generatie overwint de cellulaire toxiciteit veroorzaakt door buitensporige calcium toestroom en zorgt voor functionele studies van de receptor in een high-throughput mode, die ontdekkingen van NMDAR modulatoren versnellen kan in ziekte staten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het succes van deze test hangt grotendeels af van de gezondheid van de cellen van de HEK gebruikt. Cellen die een exponentiële groei en met lage passage nummer moet worden gebruikt. Deze bepaling omvat vele overdrachten en toevoegingen van oplossingen, dus met behulp van voorzichtigheid zorgt voor hogere nauwkeurigheid in de resultaten. Concentraties van stoffen en alle andere reagentia moeten ook kruiscontrole minimaliseren van fouten. Bij het vervangen van mobiele media met de buffer assay voor de calcium flux assay, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank het postkantoor baccalaureaat geleerden programma en Novartis instituten voor biomedisch onderzoek als een geheel voor de financiering van deze studie.
Materials
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease–systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging–need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
- Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
- Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
- Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
- Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
- Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
- Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
- Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
- Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
- Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
- Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
- Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
- Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
- Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
- Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
- Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
- Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).
- Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
- Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
- Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
- Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
- Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).
