Um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores NMDA com sensibilidade de glicina/D-serina e glutamato
Summary
O objetivo do presente protocolo é facilitar o estudo dos receptores de NMDA (NMDAR) em uma escala maior e permitir a análise dos efeitos moduladora de pequenas moléculas e suas aplicações terapêuticas.
Abstract
Receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) (NMDAR) são classificados como receptores de glutamato de geleificação e têm papel crítico na aprendizagem e memória. Mau funcionamento do NMDAR, expressado como qualquer over – ou under – activity causada por mutações, expressão alterada, tráfico ou localização, pode contribuir para inúmeras doenças, especialmente no sistema nervoso central. Portanto, compreender a biologia do receptor, bem como facilitar a descoberta de compostos e moléculas pequenas é crucial nos esforços em curso para combater doenças neurológicas. As abordagens atuais para estudar o receptor têm limitações, incluindo a incapacidade para estudar suas habilidades funcionais devido a necessária presença de bloqueadores de canais para evitar excitotoxicidade mediada por NMDAR, alto custo e baixa taxa de transferência. Além disso, os sistemas existentes de ensaio são sensíveis à estimulação por glutamato apenas e faltam de sensibilidade à estimulação por glicina, o outro ligante co do NMDAR. Aqui, apresentamos o primeiro ensaio baseado em placa de poder elevado-throughput para estudar um receptor NMDA com sensibilidade para ambos os ligantes co, glutamato e D-serina/glicina. Esta abordagem permite o estudo de diferentes composições de subunidade NMDAR e permite estudos funcionais do receptor em modos de glicina e / ou sensíveis ao glutamato. Além disso, o método não requer a presença de inibidores durante as medições. Os efeitos de moduladores alostéricos positivos e negativos podem ser detectados com este ensaio e a farmacologia conhecida de NMDAR foi replicada em nosso sistema. Esta técnica supera as limitações dos métodos existentes e é rentável. Acreditamos que esta nova técnica irá acelerar a descoberta de terapias para patologias NMDAR-mediada.
Introduction
Com os atuais avanços na medicina, a expectativa de vida aumentou significativamente; no entanto, então tem a prevalência de doenças relacionadas com a idade. Doenças do sistema nervoso central (CNS) tais como esquizofrenia, esclerose lateral amiotrófica (ela), doença de Alzheimer e doença de Parkinson, entre outros, não são excepção e tem sido projetadas para aumentar ao longo da próxima década1, 2 , 3. o mau funcionamento dos receptores de glutamato de geleificação conhecido como receptores N-metil-D-aspartato (NMDAR) tem sido associado a doença de Alzheimer, esquizofrenia, traumatismo crânio-encefálico, acidente vascular cerebral, diabetes e glaucoma, entre outros, que garante a precisa estudar sua biologia para o desenvolvimento de terapias eficazes, doença-modificando4,5,6,7.
Os NMDARs são compostos de quatro monômeros ou subunidades4,8,9. A composição estrutural do NMDAR mostra variabilidade regional e de desenvolvimento dentro do cérebro7,10. Os NMDARs estão envolvidos na plasticidade sináptica, cognição e a geração de ritmos para respiração e locomoção11,12,13. Como um canal de voltagem-dependente, é em grande parte não-condutor no potencial de membrana de repouso (-70 mV) e é bloqueado por magnésio para prevenir mais permeação de íons. O canal é activado pela ligação de dois ligantes, glutamato e a glicina/D-serina, e uma despolarização simultânea na membrana sináptica mediada por receptores de GABA, outra subclasse de receptores de glutamato de geleificação. A despolarização remove o bloqueio de magnésio de NMDAR, permitindo o influxo de cátions, particularmente cálcio14,15,16. Mesmo que a ativação do NMDAR é essencial para a sobrevivência da pilha, ativação excessiva pode levar à morte17,18,19 através da excitotoxicidade da pilha. Isso, além da natureza complexa do receptor, torna desafiador para realizar estudos necessários para o desenvolvimento de terapias eficazes.
Diferentes métodos têm sido desenvolvidos para estudar o NMDAR. No entanto, cada um tem que acompanha ressalvas. Por exemplo, uma técnica amplamente utilizada é um ensaio baseado em fluorescência que mede mudanças NMDAR-mediada em cálcio intracelular em uma linha de celular estável sob o controle de um promotor inducible-tetraciclina (Tet-On)20. No entanto, neste sistema, as concentrações de supramaximal de ligantes que são necessários e a exigência de que os inibidores NMDAR estão presentes durante a medição torna quase impossível de detectar atividade da antagonista competitivo. Em outros sistemas similares, a expressão do receptor funcional provoca toxicidade, exigir que os bloqueadores de canais como a cetamina21,22 para preservar as culturas de células. Estes bloqueadores dos canais de sentar-se no núcleo do receptor e são difíceis de lavar, especialmente em um formato baseado em placa, para que eles interfiram com estudos funcionais do receptor. Finalmente, em medidas eletrofisiológicas tais como remendo aperto, há produção limitada, e estudos em grande escala são muito caro23. Não obstante, os sistemas acima são insensíveis à estimulação de glicina; Portanto, estudando a atividade de glicina-dependente do NMDAR torna-se um desafio.
Aqui, descrevemos uma nova abordagem para o estudo NMDAR que supera as limitações discutidas. Nossa técnica capitaliza sobre o sistema de expressão de baculovirus para expressar o receptor em níveis funcionais, com uma óptima relação das subunidades em menos de 16 horas. Além disso, o uso de baculovirus permite uma abordagem simples e combinatória, que fornece uma ampla caracterização dos subtipos distintos de NMDAR recombinantes. Ao contrário de outros ensaios, este protocolo não requer bloqueadores de canal por causa do uso de antagonistas fracos. Mais forte vantagem do método é aquele fracassado depois do antagonista fraco, o receptor é sensível a modulação dos sites individual glicina e o glutamato vinculação – além de modulação dual de glicina/D-serina e glutamato ligand-ligação sites. O ensaio recapitula a farmacologia conhecida do receptor NMDAR e os efeitos de seus conhecidos moduladores positivos e negativos. Finalmente, a geração deste ensaio celular em vitro supera a toxicidade celular causada pelo influxo excessivo de cálcio e permite estudos funcionais do receptor em uma moda de alta produtividade, que pode acelerar as descobertas de moduladores NMDAR Estados de doença.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sucesso deste teste depende em grande parte a saúde das células HEK usado. Células em fase de crescimento exponencial e com número baixo de passagem deve ser usado. Este ensaio envolve muitas transferências e adições de soluções, usando então cuidado irão garantir maior precisão em seus resultados. Concentrações de compostos e todos os outros reagentes devem ser também cruzados para minimizar erros. Quando substituir a mídia celular com o buffer de ensaio para o ensaio de fluxo de cálcio, a placa deve …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer o Post Bacharelado Scholars Program Office e Novartis institutos para investigação biomédica como um todo para o financiamento deste estudo.
Materials
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
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