एक उच्च प्रवाह कैल्शियम-फ्लक्स परख मोर्फिन अध्ययन करने के लिए Glycine के लिए संवेदनशीलता के साथ रिसेप्टर्स/डी-serine और ग्लूटामेट
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक बड़े पैमाने पर मोर्फिन रिसेप्टर्स (NMDAR) के अध्ययन की सुविधा और छोटे अणुओं और उनके चिकित्सीय अनुप्रयोगों के modulatory प्रभाव की परीक्षा की अनुमति है.
Abstract
N-मिथाइल-D-aspartate (मोर्फिन) रिसेप्टर्स (NMDAR) ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के रूप में वर्गीकृत किया जाता है और सीखने और स्मृति में महत्वपूर्ण भूमिका है । NMDAR खराबी, या तो पर के रूप में व्यक्त की या के तहत उत्परिवर्तनों की वजह से गतिविधि, बदल अभिव्यक्ति, तस्करी, या स्थानीयकरण, कई रोगों के लिए योगदान कर सकते हैं, विशेष रूप से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में । इसलिए, रिसेप्टर के जीवविज्ञान को समझने के साथ ही यौगिकों और छोटे अणुओं की खोज को सुविधाजनक बनाने के लिए मस्तिष्क संबंधी रोगों का मुकाबला करने के लिए चल रहे प्रयासों में महत्वपूर्ण है. इस रिसेप्टर का अध्ययन करने के लिए वर्तमान दृष्टिकोण कम प्रवाह, उच्च लागत सहित सीमाओं है, और NMDAR-मध्यस्थता excitotoxicity को रोकने के लिए चैनल ब्लॉकर्स की आवश्यक उपस्थिति के कारण अपनी कार्यात्मक क्षमताओं का अध्ययन करने में असमर्थता. इसके अतिरिक्त, मौजूदा परख प्रणालियों ग्लूटामेट केवल और कमी glycine द्वारा उत्तेजना के लिए संवेदनशीलता के प्रति संवेदनशील हैं, अंय सह NMDAR के ligand । यहां, हम दोनों को सह लाइगैंडों, ग्लूटामेट और डी serine/glycine के लिए संवेदनशीलता के साथ एक मोर्फिन रिसेप्टर का अध्ययन करने के लिए उच्च प्रवाह शक्ति के साथ पहली थाली आधारित परख प्रस्तुत करते हैं । इस दृष्टिकोण अलग NMDAR उपइकाई रचनाओं के अध्ययन की अनुमति देता है और glycine में रिसेप्टर के कार्यात्मक अध्ययन की अनुमति देता है-और/या ग्लूटामेट-संवेदी मोड । इसके अतिरिक्त, विधि माप के दौरान अवरोधकों की उपस्थिति की आवश्यकता नहीं है । सकारात्मक और नकारात्मक allosteric मॉडुलन के प्रभाव इस परख के साथ पता लगाया जा सकता है और NMDAR के ज्ञात औषध विज्ञान हमारे सिस्टम में दोहराया गया है. इस तकनीक मौजूदा तरीकों की सीमाओं पर काबू पाता है और लागत प्रभावी है । हमें विश्वास है कि इस उपंयास तकनीक NMDAR-मध्यस्थता विकृतियों के लिए चिकित्सा की खोज में तेजी लाने जाएगा ।
Introduction
चिकित्सा में वर्तमान अग्रिमों के साथ, जीवन प्रत्याशा में काफी वृद्धि हुई है; हालांकि, इसलिए उम्र से संबंधित रोगों की व्यापकता है । केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के रोग जैसे एक प्रकार का पागलपन के रूप में, पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS), अल्जाइमर रोग, और पार्किंसंस रोग, दूसरों के बीच, कोई अपवाद नहीं हैं और अगले1दशक से अधिक वृद्धि करने के लिए पेश किया गया है, 2 , 3. N-मिथाइल-D-aspartate रिसेप्टर्स (NMDAR) के रूप में जाना ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की खराबी अल्जाइमर रोग, एक प्रकार का पागलपन, दर्दनाक मस्तिष्क चोट, स्ट्रोक, मधुमेह, और मोतियाबिंद दूसरों के बीच में जोड़ा गया है, जो वारंट के विकास के लिए अपने जीव विज्ञान का अध्ययन करने की आवश्यकता प्रभावी, रोग संशोधित चिकित्सा4,5,6,7.
NMDARs चार मोनोमर या उपइकाईयों4,8,9से बना रहे हैं । NMDAR की संरचनात्मक रचना मस्तिष्क7,10के भीतर विकासात्मक और क्षेत्रीय परिवर्तनशीलता से पता चलता है । NMDARs synaptic प्लास्टिक, अनुभूति, और श्वास और गतिवान11,12,13के लिए लय की पीढ़ी में शामिल हैं । एक वोल्टेज-gated चैनल के रूप में, यह काफी हद तक गैर आराम झिल्ली क्षमता पर आयोजित है (-७० एमवी) और मैग्नीशियम द्वारा अवरुद्ध है आयनों के आगे permeation को रोकने के । चैनल दो लाइगैंडों, ग्लूटामेट और glycine/डी-serine, और AMPA रिसेप्टर्स, ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के एक अन्य उपवर्ग द्वारा मध्यस्थता synaptic झिल्ली पर एक साथ ध्रुवीकरण के बंधन से सक्रिय है । ध्रुवीकरण NMDAR की मैग्नीशियम रुकावट को हटा, cations की आमद को सक्षम करने, विशेष रूप से कैल्शियम14,15,16। हालांकि NMDAR के सक्रियण सेल अस्तित्व के लिए आवश्यक है, अत्यधिक सक्रियण सेल मौत17,18,excitotoxicity के माध्यम से19 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यह, रिसेप्टर की जटिल प्रकृति के अलावा, यह प्रभावी चिकित्सा के विकास के लिए आवश्यक अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है.
NMDAR का अध्ययन करने के लिए अलग तरीके विकसित किए गए हैं । हालांकि, हर एक के साथ निरंतर है । उदाहरण के लिए, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक एक प्रतिदीप्ति आधारित परख है कि एक स्थिर सेल लाइन में एक टेट्रासाइक्लिन-inducible प्रमोटर (Tet-On)20के नियंत्रण के तहत intracellular कैल्शियम में NMDAR-मध्यस्थता परिवर्तन के उपाय है । हालांकि, इस प्रणाली में, लाइगैंडों की supramaximal सांद्रता कि जरूरत है और आवश्यकता है कि NMDAR अवरोधकों माप के दौरान मौजूद हैं यह लगभग असंभव प्रतिस्पर्धी विरोधी की गतिविधि का पता लगाने के लिए बनाता है. अंय इसी तरह की प्रणालियों में, कार्यात्मक रिसेप्टर की अभिव्यक्ति विषाक्तता का कारण बनता है, चैनल ब्लॉकर्स जैसे ketamine21,22 सेल संस्कृतियों के संरक्षण के लिए की आवश्यकता होती है । ये चैनल ब्लॉकर्स रिसेप्टर के कोर पर बैठते हैं और बाहर धोने के लिए मुश्किल हैं, विशेष रूप से एक थाली में आधारित प्रारूप, तो वे रिसेप्टर के कार्यात्मक अध्ययन के साथ हस्तक्षेप. अंत में, इस तरह के पैच clamping के रूप में electrophysiological माप में, सीमित प्रवाह है, और बड़े पैमाने पर अध्ययन बहुत महंगे हैं23. इसके बावजूद, उपर्युक्त प्रणालियां glycine उत्तेजना के प्रति असंवेदनशील हैं; इसलिए, NMDAR के glycine निर्भर गतिविधि का अध्ययन एक चुनौती बन जाता है ।
यहां, हम अध्ययन NMDAR कि चर्चा की सीमाओं पर काबू के लिए एक उपंयास दृष्टिकोण का वर्णन । हमारी तकनीक baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली पर मूल के रूप में छोटे रूप में 16 घंटे में उपइकाईयों का एक इष्टतम अनुपात के साथ कार्यात्मक स्तर पर रिसेप्टर व्यक्त करने के लिए कैपिटल्स । इसके अलावा, baculovirus का उपयोग एक सरल और मिश्रित दृष्टिकोण है, जो विशिष्ट रिकॉमबिनेंट NMDAR उपप्रकार का एक व्यापक लक्षण वर्णन प्रदान करता है के लिए अनुमति देता है । अंय परख के विपरीत, इस प्रोटोकॉल क्योंकि कमजोर विरोधी के उपयोग के चैनल ब्लॉकर्स की आवश्यकता नहीं है । विधि का सबसे मजबूत लाभ यह है कि कमजोर प्रतिपक्षी के वॉशआउट के बाद, रिसेप्टर दोनों glycine/डी-serine और ग्लूटामेट ligand-बाइंडिंग के दोहरे मॉडुलन के अलावा व्यक्तिगत glycine-और ग्लूटामेट-बाध्यकारी साइटों के मॉडुलन के प्रति संवेदनशील है साइटों. परख recapitulates NMDAR रिसेप्टर और इसके ज्ञात सकारात्मक और नकारात्मक मॉडुलन के प्रभाव के औषध विज्ञान जाना जाता है । अंत में, इन विट्रो में इस की पीढ़ी सेलुलर परख अत्यधिक कैल्शियम आमद की वजह से सेलुलर विषाक्तता पर काबू पाता है और एक उच्च प्रवाह फैशन में रिसेप्टर के कार्यात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है, जो NMDAR मॉडुलन की खोजों को तेज कर सकते हैं रोग राज्यों में ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस परख की सफलता का इस्तेमाल HEK कोशिकाओं के स्वास्थ्य पर काफी हद तक निर्भर करता है । घातीय वृद्धि के दौर से गुजर कोशिकाओं और कम गद्यांश संख्या के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए । इस परख कई स्थानांतरण और समाधा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस अध्ययन के वित्तपोषण के लिए एक पूरे के रूप में जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए बेक्कालॉरेट विद्वानों कार्यक्रम कार्यालय और नोवार्टिस संस्थानों के बाद शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
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