Eine Hochdurchsatz-Kalzium-Flux-Assay, NMDA-Rezeptoren mit Sensibilität für Glycin/D-Serin und Glutamat zu studieren
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Studium der NMDA-Rezeptoren (NMDAR) in einem größeren Maßstab erleichtern und ermöglichen die Prüfung der modulierende Effekte von kleinen Molekülen und deren therapeutische Anwendungen.
Abstract
N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren (NMDAR) gelten als Ionotropic Glutamat-Rezeptoren und haben entscheidende Rollen in lernen und Gedächtnis. NMDAR Störung, ausgedrückt als entweder über – oder unter – activity verursacht durch Mutationen, veränderten Ausdruck, Menschenhandel oder Lokalisierung, kann zahlreiche Krankheiten, insbesondere in das zentrale Nervensystem beitragen. Daher unbedingt Verständnis der Rezeptor Biologie sowie zur Erleichterung der Entdeckung von Verbindungen und kleine Moleküle in laufenden Bemühungen zur Bekämpfung von neurologischer Erkrankungen. Aktuelle Ansätze zur Untersuchung des Rezeptors haben Beschränkungen, einschließlich niedriger Durchsatz, hohen Kosten und der Unfähigkeit, seine funktionellen Fähigkeiten durch die notwendige Anwesenheit von Kalziumkanalblocker NMDAR-vermittelten Excitotoxizität verhindern zu studieren. Darüber hinaus die bestehenden Assay-Systeme sind empfindlich auf die Stimulation durch Glutamat nur und Empfindlichkeit auf Anregung von Glycin, die andere Co Liganden der NMDAR fehlt. Hier präsentieren wir die erste Platte-basierte Assay mit hohem Durchsatz macht einen NMDA-Rezeptor mit Sensibilität für Co-Liganden, Glutamat sowohl D-Serin/Glycin zu studieren. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der verschiedenen NMDAR Untereinheit Kompositionen und funktionelle Studien des Rezeptors in Glycin und/oder Glutamat-sensitiven Modi ermöglicht. Darüber hinaus erfordert die Methode nicht die Anwesenheit von Inhibitoren während der Messung. Die Auswirkungen der positive und negative allosterische Modulatoren können mit diesem Test erkannt werden und die bekannten Pharmakologie des NMDAR in unserem System repliziert wurden. Diese Technik überwindet die Grenzen der bestehenden Methoden und ist kostengünstig. Wir glauben, dass diese neuartige Technik die Entdeckung von Therapien für NMDAR-vermittelten Erkrankungen beschleunigen wird.
Introduction
Mit den aktuellen Fortschritten in der Medizin hat die Lebenserwartung deutlich zugenommen; Allerdings hat also die Prävalenz der altersbedingten Erkrankungen. Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Schizophrenie, Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit, unter anderem sind da keine Ausnahme und haben voraussichtlich in den nächsten zehn Jahren1, zu erhöhen 2 , 3. die Fehlfunktion von Ionotropic Glutamat-Rezeptoren bekannt als N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDAR), Alzheimer-Krankheit, Schizophrenie, Schädel-Hirn-Verletzungen, Schlaganfall, Diabetes und Glaukom u.a. die Optionsscheine verknüpft wurde die Ihre Biologie für die Entwicklung von wirksamen, krankheitsmodifizierende Therapien4,5,6,7studieren müssen.
NMDARs bestehen aus vier Monomeren oder Untereinheiten4,8,9. Das Strukturbild der NMDAR zeigt Entwicklungs- und regionale Streuung innerhalb der Gehirn-7,–10. NMDARs engagieren sich in Synaptische Plastizität, Kognition und die Generation der Rhythmen für Atmung und Fortbewegung11,12,13. Als Voltage-gated-Kanal, es ist weitgehend nicht leitend bei ruhenden Membranpotential (-70 mV) und wird durch Magnesium zur Verhinderung weiterer Permeation von Ionen blockiert. Der Kanal wird durch die Bindung von zwei Liganden, Glutamat und Glycin/D-Serin aktiviert, und eine gleichzeitige Depolarisation an der synaptischen Membran durch AMPA-Rezeptoren, eine andere Unterklasse von Ionotropic Glutamat-Rezeptoren vermittelt. Die Depolarisation entfernt die Magnesium-Blockade der NMDAR, so dass des Zustroms von Kationen, insbesondere Kalzium14,15,16. Obwohl die Aktivierung von NMDAR essentiell für das Überleben der Zelle ist, kann übermäßige Aktivierung zu Tod17,18,19 bis Excitotoxizität Zelle führen. Dies macht neben der komplexen Natur des Rezeptors, es schwierig durchzuführenden Studien notwendig für die Entwicklung wirksamer Therapien.
Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um die NMDAR zu studieren. Allerdings hat jeweils begleitenden Einschränkungen. Beispielsweise ist eine weit verbreitete Technik eine Fluoreszenz basierende Assays, die NMDAR-vermittelte Änderungen in intrazellulären Calcium in eine stabile Zelllinie unter der Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors (Tet-On)20misst. Jedoch in diesem System macht supramaximalen Konzentrationen von Liganden, die benötigt werden und die Anforderung, dass NMDAR Inhibitoren vorhanden während der Messung sind es nahezu unmöglich, Aktivität der kompetitiver Antagonist zu erkennen. In anderen ähnlichen Systemen verursacht der Ausdruck des funktionalen Rezeptors Toxizität, erfordern-Antagonisten wie Ketamin21,22 , die Zellkulturen zu bewahren. Diese Kanalblocker das Herzstück des Rezeptors sitzen und sind schwierig zu waschen, vor allem in einem Teller-basierte Format, damit sie funktionellen Studien des Rezeptors beeinträchtigt. Zu guter Letzt in elektrophysiologische Messungen wie Patch spannen, gibt es begrenzter Durchsatz, und groß angelegte Studien sind sehr teuer23. Dennoch sind die oben genannten Systeme unempfindlich gegen Glycin Stimulation; Daher wird das Studium Glycin-abhängige Aktivität von der NMDAR eine Herausforderung.
Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz für das Studium NMDAR, die die besprochenen Grenzen überwindet. Unsere Technik nutzt Baculovirus Expressionssystems Rezeptor auf Funktionsebenen mit optimalem Verhältnis der Untereinheiten in weniger als 16 Stunden zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Baculovirus für einen einfachen und kombinatorische Ansatz, wonach eine breite Charakterisierung der verschiedenen rekombinanten NMDAR Untertypen. Im Gegensatz zu anderen Assays erfordert dieses Protokoll nicht-Kanal-Blocker wegen des Einsatzes von schwachen Antagonisten. Stärkste Vorteil der Methode ist, dass nach dem Auswaschen des schwachen Antagonisten, der Rezeptor reagiert empfindlich auf Modulation der einzelnen Glycin – und Glutamat-Bindungsstellen neben duale Modulation von Glycin/D-Serin und Glutamat Ligand-Bindung Seiten. Der Assay rekapituliert bekannten Pharmakologie des NMDAR-Rezeptors und die Auswirkungen seiner bekannten positiven und negativen Modulatoren. Zu guter Letzt Generation von in-vitro- zelluläre Assays überwindet die zelluläre Toxizität verursacht durch übermäßigen Kalzium Zustrom und ermöglicht funktionelle Studien des Rezeptors in einer Hochdurchsatz-Mode, die Entdeckungen der NMDAR Modulatoren beschleunigen können bei Krankheitszuständen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Erfolg dieser Assay hängt die Gesundheit der HEK Zellen verwendet. Zellen, exponentielles Wachstum erlebt und mit niedrigen Passagenanzahl sollte verwendet werden. Dieser Test beinhaltet viele Transfers und Ergänzungen von Lösungen, also mit Vorsicht sorgt für höhere Genauigkeit des Ergebnisses. Konzentrationen von Verbindungen und alle anderen Reagenzien sollten auch abgeglichen, Fehler zu minimieren. Beim Austausch der Zelle Medien mit dem Assay-Puffer für die Kalzium-Flux-Assay sollte die Platte vorsichtig g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten den Post Baccalaureate Scholars Program Office und Novartis Institutes for BioMedical Research als Ganzes für die Finanzierung dieser Studie danken.
Materials
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
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