Saccharomyces cerevisiae Eksponentiel vækst kinetik i Batch kultur til at analysere respiratorisk og Fermentativ stofskifte

Summary

Her præsenterer vi en protokol for at anslå den respiratoriske og Fermentativ metabolisme ved at montere den eksponentielle vækst af Saccharomyces cerevisiae eksponentiel vækst ligningen. Beregning af de kinetiske parametre giver mulighed for screening af påvirkninger af stoffer/forbindelser på gæring eller mitokondrie respiration.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae celler i den eksponentielle fase opretholde deres vækst ved at producere ATP gennem gæring og/eller mitokondrie respiration. Gæringsdygtigt CO2 koncentration regulerer hovedsagelig, hvordan gærcellen generere ATP; således, variation i fermenterbare kulhydrater niveauer drev S. cerevisiaeenergiske metabolisme. Dette papir beskriver en høj overførselshastighed metode baseret på eksponentiel gær vækst til at vurdere virkningerne af koncentration og arten af kulstof kilde på luftvejene og Fermentativ stofskifte. Vækst af S. cerevisiae er målt i en mikrotiterplade eller rystet konisk kolbe ved at bestemme det optisk densitet (OD) på 600 nm. Derefter, en vækstkurven er bygget af plotting OD versus tid, hvilket giver mulighed for identifikation og udvælgelse af den eksponentielle fase, og er udstyret med eksponentiel vækst ligning at opnå kinetiske parametre. Lav-specifik tilvækst med højere fordobling gange generelt repræsenterer en respiratorisk vækst. Omvendt, højere-specifik tilvækst med lavere fordobling gange angive Fermentativ vækst. Tærskelværdier for fordobling tid og specifikke vækstrate estimeres ved hjælp af velkendte respiratorisk eller Fermentativ betingelser, såsom ikke-fermenterbare carbon kilder eller højere koncentrationer af Gæringsdygtigt sukker. Dette er opnået for hver specifikke stamme. Endelig, de beregnede kinetiske parametre er sammenlignet med tærskelværdier at etablere om gæren viser Fermentativ og/eller respiratorisk vækst. Fordelen ved denne metode er dens relative enkelhed for forstå virkningerne af et stof/sammensat på Fermentativ eller respiratoriske stofskifte. Det er vigtigt at fremhæve, at vækst er en indviklede og komplekse biologiske proces; Derfor, foreløbige data fra denne metode skal være bekræftet af kvantificeringen af iltforbrug og ophobning af gæring biprodukter. Derved kan denne teknik bruges som en indledende screening af forbindelser/stoffer, der kan forstyrre eller forbedrer Fermentativ eller respiratoriske stofskifte.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae vækst har fungeret som et værdifuldt redskab til at identificere snesevis af fysiologiske og molekylære mekanismer. Vækst måles primært af tre metoder: serielle fortyndinger for spot test, kolonidannende enhed optælling og vækstkurver. Disse teknikker kan bruges alene eller i kombination med en bred vifte af substrater, miljøforhold, mutanter og kemikalier til at undersøge konkrete svar eller fænotyper.

Mitokondrie respiration er en biologisk proces, hvor vækst kinetik har været anvendt med succes til at opdage ukendte mekanismer. I dette tilfælde tilskud af vækst medier med ikke-fermenterbare carbon kilder såsom glycerol, laktat eller ethanol (som er udelukkende metaboliseres af mitokondrie respiration), som den eneste CO2 og energi kilde giver mulighed for at vurdere de respiratorisk vækst, hvilket er vigtigt at opdage perturbationer i oxidativ fosforylering aktivitet¹. På den anden side er det kompliceret at bruge vækst kinetiske modeller som en metode til at decifrere mekanismerne bag gæring.

Undersøgelse af gæring og mitokondriel respiration er afgørende for at belyse de molekylære mekanismer bag bestemte fænotyper som Crabtree og Warburg virkninger^2,3. Crabtree effekt er karakteriseret ved en stigning af glykolytiske flux, undertrykkelse af mitokondrie respiration, og etablering af gæring som den primære vej til at generere ATP i overværelse af høje koncentrationer af fermenterbare kulhydrater (> 0,8 mM)^4,5. Warburg effekt er metabolisk analog til Crabtree effekt, med forskellen er, at i pattedyrceller, den vigtigste produkt af gæring er laktat⁶. Faktisk er Warburg effekt udstillet af en bred vifte af kræftceller, udløser glukoseoptagelse og forbrug selv i nærværelse af ilt⁷. Derved, har at studere det molekylære grundlag af skiftet fra respiration til gæring i Crabtree effekt både bioteknologiske følger (for ethanolproduktion) og potentielle virkninger i kræftforskning.

S. cerevisiae vækst kan være et velegnet redskab til at studere effekterne Crabtree og Warburg. Denne idé er at i gær eksponentiel fase, den centrale veje bruges til at producere ATP er mitokondrie respiration og gæring, som er afgørende for at opretholde væksten. For eksempel, er vækst af S. cerevisiae tæt relateret til funktionen af ATP-genererende veje. I S. cerevisiae, mitokondrie respiration producerer ca 18 ATP molekyler per glukosemolekyle, mens gæring kun genererer 2 ATP molekyler, forventes derfor det, at væksten har snævre forbindelse med de metaboliske omsætningsveje producerer ATP⁸. I denne henseende, når gæringen er den vigtigste vej til at generere ATP, kompenserer gæren for den lave ATP produktion ved at øge satsen for glukoseoptagelse. Tværtimod er glukose forbrug af gærceller, som bruger mitokondrie respiration som ATP hovedkilden lav. Dette indikerer, at det er vigtigt for gær til forstand kulhydrat tilgængelighed før det besluttes, hvordan ATP skal genereres. Derfor, glucose tilgængelighed spiller en vigtig rolle i kontakten mellem gæring og mitokondriel respiration i S. cerevisiae. Ved tilstedeværelse af store mængder af glukose foretrækker gær gæring som den centrale rute til at generere ATP. Interessant, når gæren gæring, bevares den specifikke vækstrate på dens maksimale. På den anden side under lave niveauer af glukose producerer S. cerevisiae ATP ved hjælp af mitokondrie respiration, opretholde lavere vækstrater. Dermed, variation i koncentrationen af glukose og brugen af andre kulstof kilder fremkalde ændringer i gærs præference mellem Fermentativ og respiratoriske vækst. Under hensyntagen til dette forhold med eksponentiel vækst ligning, kan man opnå den biologiske betydning af kinetiske parametre såsom fordobling tid (Dt) og specifikke vækstrate (µ). For eksempel, blev lavere μ værdier fundet når gæren bruger mitokondrie respiration som den primære vej. Tværtimod, under forhold, der favoriserer gæring, blev højere µ værdier fundet. Denne metode kan bruges til at måle de sandsynlige mekanismer af nogen kemikalier, der påvirker gæring og mitokondriel respiration i S. cerevisiae.

Formålet med dette papir er at foreslå en metode baseret på vækst kinetik for screening virkninger af et givet stof/sammensat på mitokondrie respiration eller gæring.

Protocol

1. dyrkningsmedier og inokulum forberedelse Forberede 100 mL 2% gær extract-pepton-dextrose (YPD) flydende medium (tilføje 1 g gær extract, 2 g af kasein pepton, og 2 g af glukose til 100 mL med destilleret vand). Dispensere 3 mL af medierne i 15 mL steriliserbar koniske rør. Autoklave medier i 15 min ved 121 ° C og 1,5 psi.Bemærk: Medierne kan opbevares i op til en måned på 4-8 ° C. Podes en koniske rør fyldt med 3 mL af cool sterile 2% YPD bouillon med 250 μL af S. cerevisiae…

Representative Results

Vækstkurver kan bruges til foreløbigt forskelsbehandle respiratorisk og Fermentativ fænotyper i S. cerevisiae gær. Derfor, vi udføres batch kulturer af S. cerevisiae (BY4742) med forskellige glucose koncentrationer, der er blevet rapporteret til at fremkalde Fermentativ vækst: 1%, 2% og 10% (w/v)9. Kulturer viser et Fermentativ fænotype har en lille forsinkelse og en eksponentiel fase med en høj vækstrate (figur 1</st…

Discussion

Har gået lang tid, da J. Monod¹⁰ gav udtryk for, at undersøgelsen af vækst af bakterielle kulturer er den grundlæggende metode til mikrobiologi. Fremkomsten af de molekylære værktøjer forsinkelser skik og undersøgelse af vækst som en teknik. På trods af kompleksiteten af vækst, som involverer mange indbyrdes forbundne processer, kan dens underliggende mekanismer beskrives ved hjælp af matematiske modeller¹¹. Dette er en robust tilgang, der kan bruges som et supp…

Materials

Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures