Saccharomyces cerevisiae Exponentielles Wachstum Kinetik in Batch-Kultur, Atem- und fermentativen Stoffwechsel analysieren

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Atemwege und fermentativen Stoffwechsel durch den Einbau des exponentiellen Wachstums von Saccharomyces Cerevisiae exponentielles Wachstum Gleichung zu schätzen. Berechnung der kinetischen Parameter kann für das Screening der Einflüsse der Stoffe/Verbindungen auf Gärung oder mitochondriale Atmung.

Abstract

Saccharomyces Cerevisiae Zellen in der exponentiellen Phase unterstützen ihr Wachstum durch die Produktion von ATP durch Gärung und/oder mitochondriale Atmung. Der vergärbaren Kohlenstoffgehalt regelt vor allem, wie die Hefezellen ATP erzeugen; so treibt die Variation in vergärbare Kohlenhydrate Ebenen den Energiestoffwechsel von S. Cerevisiae. Dieses Whitepaper beschreibt eine Hochdurchsatz-Methode basiert auf exponentielle Hefe Wachstum, die Auswirkungen von Änderungen der Konzentration und Art der Kohlenstoffquelle auf Atemwege und fermentativen Stoffwechsel zu schätzen. Das Wachstum von S. Cerevisiae ist in einer Mikrotestplatte gemessen oder geschüttelt konischen Kolben durch die Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm. Dann baut eine Wachstumskurve durch Plotten OD im Vergleich zur Zeit, was ermöglicht die Erkennung und Auswahl der exponentiellen Phase und ist ausgestattet mit der exponentiellen Wachstums-Gleichung, kinetische Parameter zu erhalten. Geringen spezifischen Wachstumsraten mit höheren Verdoppelung Zeit repräsentieren in der Regel eine respiratorische Wachstum. Im Gegensatz dazu zeigen höhere spezifische Wachstumsraten mit niedrigeren Verdoppelung Mal fermentative Wachstum. Grenzwerte der Verdoppelung der Zeit und spezifischen Wachstumsrate sind anhand der bekannteste Atem- oder fermentative Bedingungen wie nicht vergärbaren Kohlenstoffquellen oder höhere Konzentrationen an vergärbaren Zucker geschätzt. Dies ist für jede spezifische Belastung erreicht. Schließlich sind die berechneten kinetischen Parameter gegenüber der Schwellenwerte um festzustellen, ob die Hefe fermentative und/oder Atemwege Wachstum zeigt. Der Vorteil dieser Methode ist die relative Einfachheit für das Verständnis der Auswirkungen einer Substanz/Verbindung auf fermentative oder respiratorischen Stoffwechsel. Es ist wichtig, hervorzuheben, dass das Wachstum eines komplizierten und komplexen biologischen Verfahrens; vorläufige Daten aus dieser Methode müssen daher durch die Quantifizierung der Sauerstoffverbrauch und Akkumulation von Gärreste erhärtet werden. Dabei kann diese Technik als eine Vorauswahl von Verbindungen/Substanzen verwendet werden, die möglicherweise stören oder fermentativer oder respiratorischen Stoffwechsel.

Introduction

Saccharomyces Cerevisiae Wachstum diente als ein wertvolles Werkzeug, Dutzende von physiologischen und molekularen Mechanismen zu identifizieren. Wachstum wird hauptsächlich durch drei Methoden gemessen: Verdünnungsreihen für Stichproben, koloniebildenden Stückzählen und Wachstumskurven. Diese Techniken können allein oder in Kombination mit einer Vielzahl von Substraten, Umweltbedingungen, Mutanten und Chemikalien verwendet werden, um konkrete Antworten oder Phänotypen zu untersuchen.

Mitochondriale Atmung ist ein biologischer Prozess, in dem Wachstum Kinetik erfolgreich angewendet wurde für die Entdeckung unbekannter Mechanismen. In diesem Fall die Supplementierung von Wachstumsmedien mit nicht vergärbaren Carbon Quellen wie z. B. Glycerin, Lactat oder Ethanol (die ausschließlich durch die mitochondriale Atmung metabolisiert werden), denn die einzige Quelle für Kohlenstoff und Energie ermöglicht eine Bewertung der Atemwege Wachstum, das ist wichtig, um Störungen in Oxidative Phosphorylierung Aktivität¹zu erkennen. Auf der anderen Seite ist es kompliziert, kinetische Wachstumsmodelle als eine Methode für die Entschlüsselung der Mechanismen hinter Gärung zu verwenden.

Das Studium der Gärung und die mitochondriale Atmung ist wichtig, die molekularen Mechanismen hinter bestimmten Phänotypen wie der Crabtree und Warburg Effekte^2,3aufzuklären. Die Crabtree-Effekt zeichnet sich durch eine Steigerung der glykolytischen Flussmittel, Unterdrückung der mitochondrialen Atmung und Einrichtung der Gärung als der primäre Weg zum ATP in Gegenwart von hohen Konzentrationen von vergärbare Kohlenhydrate generieren (> 0,8 mM)^4,5. Die Warburg-Effekt ist metabolisch analog zu der Crabtree-Effekt, mit dem Unterschied, dass in Säugerzellen, das Hauptprodukt der Gärung Laktat⁶ist. In der Tat ist der Warburg-Effekt durch eine Vielzahl von Krebszellen auslösen Glukoseaufnahme und Verbrauch auch in Gegenwart von Sauerstoff⁷ausgestellt. Dabei hat untersuchen die Molekulare Grundlagen der die Umstellung von Atmung auf Gärung in der Crabtree-Effekt biotechnologische folgen (für Ethanol-Produktion) und mögliche Auswirkungen in der Krebsforschung.

S. Cerevisiae Wachstum möglicherweise ein geeignetes Instrument zur Untersuchung der Auswirkungen von Crabtree und Warburg. Diese Idee ist, dass in der Hefe exponentielle Phase, die zentrale Wege verwendet, um ATP zu produzieren sind mitochondriale Atmung und Gärung, die wesentlich für nachhaltiges Wachstum. Zum Beispiel ist das Wachstum von S. Cerevisiae die Funktion der ATP-Erzeugung Bahnen eng verwandt. In S. Cerevisiae, die mitochondriale Atmung produziert ca. 18 ATP-Moleküle pro Glucose-Molekül während der Gärung nur 2 ATP-Moleküle erzeugt wird daher erwartet, dass die Wachstumsrate enge Verbindungen mit der Stoffwechselwege hat Herstellung von ATP⁸. In diesem Zusammenhang bei der Gärung ist der Hauptweg, ATP zu generieren, kompensiert die Hefe die geringe ATP-Produktion durch Erhöhung der Glukoseaufnahme. Im Gegenteil, ist der Glukose-Verbrauch von Hefezellen, die mitochondriale Atmung als die Hauptquelle der ATP zu verwenden gering. Dies bedeutet, dass es wichtig für die Hefe zu Sinn Kohlenhydrat Verfügbarkeit vor der Entscheidung, wie ATP generiert wird. Daher Glukose Verfügbarkeit spielt eine wichtige Rolle in der Wechsel zwischen Gärung und die mitochondriale Atmung in S. Cerevisiae. In Anwesenheit von hohen Mengen an Glukose bevorzugt die Hefe Gärung als die zentrale Route um ATP zu erzeugen. Interessant ist, wenn die Hefe Gärung ist, bleibt der spezifischen Wachstumsrate maximal. Auf der anderen Seite unter den niedrigen Niveaus von Glukose produziert S. Cerevisiae ATP mitochondriale Atmung mit geringere Wachstumsraten beibehalten. Dabei Unterschiede in der Konzentration von Glukose und die Verwendung von anderen Kohlenstoffquellen induzieren Veränderungen in der Hefe Präferenz zwischen fermentative und Atemwege Wachstum. Unter Berücksichtigung dieser Tatsache mit der exponentiellen Wachstums-Gleichung kann man die biologische Bedeutung der kinetischen Parameter wie die Verdoppelung der Zeit (Dt) und spezifischen Wachstumsrate (µ) erhalten. Zum Beispiel wurden niedrigere µ -Werte gefunden, wenn die Hefe mitochondriale Atmung als primäre Pfad verwendet. Im Gegenteil, fanden sich unter Bedingungen, die Gärung zu begünstigen, höhere µ -Werte. Diese Methode kann verwendet werden, um die wahrscheinlichen Mechanismen von Chemikalien die Gärung und mitochondriale Atmung in Messen S. Cerevisiae.

Das Ziel dieses Papiers ist es, eine Methode basierend auf Wachstum Kinetik für das screening der Auswirkungen einer bestimmten Substanz/Verbindung auf mitochondriale Atmung oder Gärung.

Protocol

(1) Kultur, Medien und Inokulum Vorbereitung 100 mL 2 % Hefe-Extrakt-Pepton-Traubenzucker (YPD) flüssigen Medium vorbereiten (1 g Hefe-Extrakt, Kasein Pepton, 2 g und 2 g Glucose in 100 mL destilliertem Wasser hinzufügen). 3 mL der Medien in 15 mL sterilisierbare konische Rohre zu verzichten. Autoklaven der Medien für 15 min bei 121 ° C und 1,5 Psi.Hinweis: Der Datenträger kann bis zu einem Monat bei 4 – 8 ° c aufbewahrt werden Impfen Sie eine konische Rohr gefüllt mit 3 mL cool steril 2 …

Representative Results

Wachstumskurven lässt sich vorläufig zwischen Atem- und fermentative Phänotypen in der Hefe S. Cerevisiae zu unterscheiden. Daher führten wir Batch Kulturen von S. Cerevisiae (BY4742) mit verschiedenen Glukosekonzentration, die fermentative Wachstum induzieren gemeldet wurden: 1 %, 2 % und 10 % (w/V)9. Zeigt einen fermentativen Phänotyp Kulturen haben eine kleine Verzögerung und eine exponentielle Phase mit einer hohen Wachstumsrate (<strong…

Discussion

Eine lange Zeit ist vergangen, seit J. Monod¹⁰ zum Ausdruck gebracht, dass die Untersuchung des Wachstums von Bakterienkulturen die grundlegende Methode der Mikrobiologie. Das Aufkommen der Molekulare Werkzeuge verzögert die Nutzung und das Studium des Wachstums als eine Technik. Trotz der Komplexität des Wachstums die zahlreichen miteinander verbundenen Prozesse umfasst, können die zugrunde liegenden Mechanismen mithilfe mathematischer Modelle¹¹beschrieben werden. Dies …

Materials

Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures