Пивоваренные дрожжи Экспоненциальный рост кинетика в культуре партии для анализа дыхания и ферментативным метаболизма
Summary
Здесь мы представляем протокол для оценки метаболизм дыхания и ферментативным путем установки экспоненциальный рост Saccharomyces cerevisiae экспоненциальный рост уравнения. Расчета кинетических параметров позволяет для проверки влияния веществ/соединений на брожение или митохондриальное дыхание.
Abstract
Пивоваренные дрожжи клетки в экспоненциальной фазе роста, производя СПС через ферментации и/или митохондриальное дыхание. Концентрация углерода сбраживаемых главным образом регулирует как дрожжевых клеток генерировать СПС; Таким образом различия в уровнях сбраживаемых углеводов диски энергетический метаболизм S. cerevisiae. Этот документ описывает метод высокой пропускной способностью на основе экспоненциального дрожжей роста для оценки последствий изменения концентрации и характер источника углерода на метаболизм дыхания и ферментативной. Рост S. cerevisiae измеряется в Гонав или потрясен конической колбе путем определения оптической плотности (OD) на 600 Нм. Затем кривая роста построен построения ОД против времени, что позволяет выявление и отбор экспоненциальной фазе и оснащен экспоненциальный рост уравнение для получения кинетическими параметрами. Низкие конкретные темпы роста с выше удвоение раз обычно представляют дыхания рост. И наоборот более высокие темпы роста конкретных с нижней удвоение раз указывают на ферментативную рост. Пороговые значения удвоения время и темп роста конкретных оцениваются с помощью хорошо известных дыхания или ферментативную условия, такие как источников без сбраживаемых углерода или более высокие концентрации сбраживаемых Сахаров. Это получается для каждого конкретного штамма. Наконец рассчитанные кинетических параметров сравниваются с пороговые значения установить ли дрожжи показывает ферментативной и/или респираторных роста. Преимуществом данного метода является его относительная простота для понимания воздействия вещества/смеси на ферментативную или дыхательных путей метаболизма. Важно подчеркнуть, что рост является сложной и сложной биологический процесс; Таким образом предварительные данные из этого метода должен быть подтвержден количественная оценка потребления кислорода и накоплением побочные продукты брожения. Таким образом этот метод может использоваться как предварительный скрининг соединений/веществ, которые могут нарушить или улучшают ферментативную или дыхательных путей метаболизма.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae роста служит ценным инструментом для выявления десятки физиологических и молекулярных механизмов. Рост измеряется прежде всего тремя методами: серийных разведений для выборочной проверки, образуя колонии единица подсчета и кривых роста. Эти методы могут использоваться отдельно или в сочетании с различными субстратами, экологических условий, мутантов и химических веществ расследовать конкретные ответы или фенотипов.
Митохондриальное дыхание-это биологический процесс, в котором Кинетика роста успешно применяется для обнаружения неизвестных механизмов. В этом случае добавок питательных сред с без сбраживаемых углерода источников таких как глицерин, лактат или этанол (которые являются исключительно метаболизируется путем митохондриальное дыхание), как единственного источника углерода и энергии позволяет для оценки респираторные роста, который имеет важное значение для выявления возмущений в окислительного фосфорилирования деятельности1. С другой стороны это сложно пользоваться кинетической модели роста как метод для расшифровки механизмов за брожения.
Изучение митохондриального дыхания и брожения имеет важное значение для прояснения молекулярных механизмов за определенные фенотипов например Крабтри и Варбург эффекты2,3. Crabtree эффект характеризуется увеличением гликолитических потока, репрессии митохондриальное дыхание и создание ферментации как основной путь для генерации АТФ в присутствии высоких концентраций сбраживаемых углеводов (> 0,8 мм)4,5. Варбург эффект метаболически аналого-Crabtree эффект, с той разницей, что в клетках млекопитающих, основным продуктом ферментации молочной кислоты6. Действительно Варбург эффект проявляется на различных раковых клеток, вызывая глюкозы и потребления даже в присутствии кислорода7. Таким образом изучая молекулярные основы перехода от дыхания для ферментации в Crabtree эффект в биотехнологических последствия (для производства этанола) и потенциального воздействия исследований рака.
S. cerevisiae рост может быть подходящим инструментом для изучения влияния Crabtree и Варбург. Эта идея основывается на том, что в экспоненциальной фазе дрожжей, Центральный путей, используемых для производства АТФ, митохондриальных дыхания и брожения, которые необходимы для поддержания экономического роста. Например рост S. cerevisiae тесно связано с функции генерации АТФ пути. В S. cerevisiae, митохондриальное дыхание производит приблизительно 18 ATP молекулы на молекулу глюкозы тогда как ферментация генерирует только 2 молекулы АТФ, поэтому ожидается что темпы роста имеет тесные связи с метаболических производства АТФ8. В этой связи когда брожение является основной маршрут для генерации АТФ, дрожжи компенсирует низкий уровень производства АТФ, увеличивая скорость поглощения глюкозы. Напротив потребление глюкозы клетками дрожжей, которые используют митохондриальное дыхание как основной источник АТФ является низким. Это означает, что это важно для дрожжей в смысле наличия углеводов до определения того, как будет создаваться СПС. Таким образом, наличие глюкозы играет важную роль в переключение между ферментации и митохондриальное дыхание в S. cerevisiae. При наличии большого количества глюкозы дрожжи предпочитает ферментации как Центральный маршрут для генерации АТФ. Интересно, что когда дрожжи брожения, темпы роста конкретных поддерживается на своего максимума. С другой стороны под низкий уровень глюкозы, S. cerevisiae производит АТП с использованием митохондриальное дыхание, поддержание темпов роста. Таким образом различия в концентрации глюкозы и использование других источников углерода вызывают изменения в дрожжи предпочтения между роста ферментативной и дыхания. Принимая во внимание этот факт с помощью уравнения экспоненциальный рост, можно получить Биологическая смысль кинетических параметров, таких как удвоение время (Dt) и конкретных прирост (мкг). Например более низкие значения µ были найдены когда дрожжи в качестве основного пути использует митохондриальное дыхание. Напротив в условиях, которые способствуют ферментации, были обнаружены высокие значения µ . Эта методология может использоваться для оценки вероятных механизмов любых химических веществ, влияющих на брожение и митохондриальное дыхание в S. cerevisiae.
Цель этого документа должна предложить метод, основанный на Кинетика роста для проверки воздействия данного вещества/смеси на митохондриальное дыхание или ферментации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Много времени прошло с момента J. Monod10 выразил, что изучение роста бактериальных культур является основным методом микробиологии. Появление молекулярной инструменты задержки использования и изучения роста как техника. Несмотря на сложность роста, которая включает в себя м…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был поддержан, предоставляет Consejo Nacional de науки y Tecnología (Грант № 293940) и Фонд “Телмекс”-TELCEL (Грант № 162005585), оба с ИКОМ.
Materials
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
- Parrella, E., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods. 46 (4), 256-262 (2008).
- Rosas Lemus, M., et al. The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
- Xu, X. D., et al. Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism. Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).
- De Deken, R. H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).
- Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).
- Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction?. Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).
- Keating, E., Martel, F. Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism. Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).
- Pfeiffer, T., Morley, A. An evolutionary perspective on the Crabtree effect. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).
- Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).
- Cui, S., Xu, S. Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation. Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).
- Benzekry, S., et al. Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth. Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).
- Ramos-Gomez, M., et al. Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).
- Madrigal-Perez, L. A., et al. Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).
