Saccharomyces cerevisiae Üstel büyüme kinetik solunum ve fermantatif metabolizma analiz etmek için toplu iş kültüründe
Summary
Burada solunum ve fermantatif metabolizma Saccharomyces cerevisiae üstel büyüme üstel büyüme Denklem için yaklaştırarak tahmin etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Kinetik parametrelerin hesaplanması maddeler/bileşikler etkileri fermantasyon veya mitokondrial solunum testi ile taranması için izin verir.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae hücreleri veya üssel faz olarak onların büyüme fermantasyon ve/veya mitokondrial solunum ATP üreten sürdürmek. Fermente karbon konsantrasyonu esas olarak Maya hücreleri ATP oluşturmak nasıl yönetir; Böylece, fermente karbonhidrat düzeyleri varyasyon S. cerevisiaeenerjik metabolizma kullanıyor. Bu kağıt toplama değişikliklerin etkisini ve solunum ve fermantatif metabolizmasına karbon kaynağı niteliği tahmin etmek için üstel Maya büyüme dayalı yüksek üretilen iş yöntemi açıklanır. S. cerevisiae büyüme bir Mikroplaka ölçülen veya konik sarsıldı 600 optik yoğunluk (OD) malzemelerini şişesi nm. Sonra bir büyüme eğrisi zaman, hangi kimlik ve üssel faz yelpazesi sağlar ve üstel büyüme denklemle kinetik parametrelerin elde etmek için monte karşı çizdirme OD tarafından inşa edilmiştir. Düşük belirli büyüme oranları daha yüksek katlama süreler genellikle solunum büyüme temsil eder. Buna karşılık, daha yüksek belirli büyüme oranları daha düşük katlama kez fermantatif büyüme gösterir. Zaman ve belirli büyüme oranı iki katına eşik değerleri fermente karbon kaynakları veya daha yüksek konsantrasyonlarda fermente şekerler gibi iyi bilinen solunum veya fermantatif koşullar kullanarak tahmin edilir. Bunun için belirli her zor elde edilir. Son olarak, hesaplanan kinetik parametrelerin Maya fermantatif ve/veya solunum büyüme gösterip göstermediğini kurmak için eşik değerleri ile karşılaştırılır. Bu yöntemin avantajı fermantatif veya solunum metabolizma bir madde/bileşik etkilerini anlamak için göreli basitliğidir. Büyüme karışık ve karmaşık bir biyolojik süreç olduğunu vurgulamak önemlidir; Bu nedenle, bu yöntem ilk veri oksijen tüketim miktar ve fermantasyon yan birikimi tarafından corroborated gerekir. Böylece, bu teknik bileşikler/maddeler rahatsız ya da fermantatif veya solunum metabolizma artırmak bir ön elemeyi olarak kullanılabilir.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae büyüme fizyolojik ve moleküler mekanizmaları onlarca tanımlamak için değerli bir araç hizmet vermiştir. Büyüme öncelikle üç yöntemlerle ölçülen: spot test, koloni oluşturan birim sayma ve büyüme eğrileri seri dilutions. Bu teknikler belirli yanıtlar veya fenotipleri araştırmak için tek başına veya birlikte çeşitli yüzeyler, çevre koşulları, mutantlar ve kimyasallar ile kullanılabilir.
Mitokondrial solunum içinde büyüme kinetik başarıyla bilinmeyen mekanizmaları keşfetmek için uygulanmış olan biyolojik bir süreçtir. Bu durumda, tek karbon ve enerji kaynağı değerlendirmek için izin verdiğinden takviyesi ile fermente karbon büyüme ortamının gliserol, laktat veya (ki sadece mitokondrial solunum tarafından metabolize) etanol gibi kaynakları Solunum büyüme, tedirginlikler Oksidatif fosforilasyon faaliyet1‘ algılamak önemlidir. Diğer taraftan, fermantasyon arkasında mekanizmaları deşifre bir yöntem olarak büyüme kinetik modelleri kullanmak karmaşıktır.
Fermantasyon ve mitokondrial solunum Crabtree ve Warburg etkileri2,3gibi belirli fenotipleri arkasında moleküler mekanizmaları aydınlatmak için esastır. Crabtree etkisi ile karakterize bir artış glycolytic akı, baskı mitokondrial solunum ve fermantasyon ATP fermente karbonhidrat yüksek konsantrasyonda huzurunda oluşturmak için birincil yolu olarak kurulması (> 0.8 mM)4,5. Memeli hücrelerinde, ana, fermantasyon laktat6ürünü Warburg etkisi metabolik olarak Crabtree etkisi farkı ile analog bu olmak. Gerçekten de, kanser hücrelerinin, Glikoz alımı ve tüketimi bile oksijen7huzurunda uyarının harekete geçirilmesine karşılık çeşitli tarafından Warburg etkisi sergilenmektedir. Böylece, solunum geçiş Crabtree etkisi fermantasyon için moleküler temeli eğitim biyoteknolojik yankıları (etanol üretimi için) hem de olası etkileri kanser araştırma vardır.
S. cerevisiae büyüme Crabtree ve Warburg etkileri çalışmaya uygun bir araç olabilir. Maya üssel faz mitokondrial solunum ve fermantasyon, büyüme sürdürmek için gerekli olan ATP üretmek için kullanılan merkezi yolları vardır gerçeğine dayanarak bu fikir. Örneğin, S. cerevisiae gelişimini yakından ATP üretme yolları fonksiyonuyla ilişkilidir. Fermantasyon sadece 2 ATP molekülleri, üretir, ancak glukoz molekülü başına S. cerevisiae ‘ mitokondrial solunum üretir yaklaşık 18 ATP molekülleri, bu nedenle bu büyüme hızı metabolik yollar ile sıkı bağlantıları bulunmaktadır bekleniyor üreten ATP8. Fermantasyon ATP üretmek için ana yolu olduğunda, bu bağlamda, Maya düşük ATP üretimi için Glikoz alımı hızını artırarak dengeler. Aksine, mitokondrial solunum ana ATP kaynağı olarak kullanmak Maya hücreleri glikoz tüketiminden düşüktür. Bu ATP nasıl oluşturulacaklarını belirleme önce Maya duyu karbonhidrat durumu için önemli olduğunu gösterir. Bu nedenle, glikoz kullanılabilirlik fermantasyon ve mitokondrial solunum arasında geçiş içinde önemli bir rol oynar S. cerevisiae. Huzurunda yüksek miktarda glikoz Maya fermantasyon ATP üretmek için orta yol olarak tercih ediyor. İlginçtir, Maya fermantasyon belirli büyüme oranı, en yüksek seviyede korunur. Öte yandan, glikoz seviyesinin düşük altında S. cerevisiae düşük büyüme oranları koruyarak mitokondrial solunum, kullanarak ATP üretir. Böylece, toplama varyasyon glikoz ve diğer karbon kaynaklarının Maya’nın tercihi fermantatif ve solunum büyüme arasında değişimler ikna etmek. Üstel büyüme denklem bu gerçeği dikkate alarak, bir saat (Dt) ve belirli büyüme hızı (µ) iki katına gibi kinetik parametrelerin biyolojik anlamını elde edebilirsiniz. Örneğin, Maya birincil yolu mitokondrial solunum kullandığında alt µ değerleri bulunmuştur. Aksine, fermantasyon lehine koşullar altında yüksek µ değerleri bulunmuştur. Bu metodoloji fermantasyon ve mitokondrial Solunum etkileyen herhangi bir kimyasal muhtemel mekanizmaları ölçmek için kullanılabilir S. cerevisiae.
Bu kağıt amacı belirli bir madde/bileşik etkilerini mitokondrial solunum veya fermantasyon süzmek için büyüme kinetik esas alarak bir yöntemini teklif etmektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
J. Monod10 bakteriyel kültürlerde büyüme çalışmanın Mikrobiyoloji temel yöntemi olduğunu ifade beri uzun zaman geçti. Moleküler araçları gelişiyle kullanım ve çalışma bir teknik olarak büyüme geciktirir. Çok sayıda birbiriyle ilişkili süreçlerinden büyüme karmaşıklığına rağmen onun temel mekanizmaları matematiksel modeller11kullanarak tanımlanabilir. En karmaşık moleküler mekanizmaları12aydınlatmak için tamam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje desteklenmiştir göre Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (grant numarası 293940) ve Fundación TELMEX-TELCEL (grant sayı 162005585), IKOM için her ikisi de verir.
Materials
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
- Parrella, E., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods. 46 (4), 256-262 (2008).
- Rosas Lemus, M., et al. The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
- Xu, X. D., et al. Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism. Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).
- De Deken, R. H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).
- Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).
- Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction?. Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).
- Keating, E., Martel, F. Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism. Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).
- Pfeiffer, T., Morley, A. An evolutionary perspective on the Crabtree effect. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).
- Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).
- Cui, S., Xu, S. Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation. Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).
- Benzekry, S., et al. Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth. Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).
- Ramos-Gomez, M., et al. Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).
- Madrigal-Perez, L. A., et al. Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).
