Saccharomyces cerevisiae श्वसन और Fermentative चयापचय का विश्लेषण करने के लिए बैच संस्कृति में घातीय वृद्धि कैनेटीक्स
Summary
यहां हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान घातीय वृद्धि समीकरण को Saccharomyces cerevisiae की घातीय वृद्धि फिटिंग द्वारा श्वसन और fermentative चयापचय का अनुमान है । काइनेटिक मापदंडों की गणना किण्वन या mitochondrial श्वसन पर पदार्थों/यौगिकों के प्रभाव की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है ।
Abstract
घातीय चरण में Saccharomyces cerevisiae कोशिकाओं किण्वन और/या mitochondrial श्वसन के माध्यम से एटीपी उत्पादन द्वारा उनके विकास को बनाए रखने । किण्वन कार्बन एकाग्रता मुख्य रूप से नियंत्रित करता है कि कैसे खमीर कोशिकाओं एटीपी उत्पंन; इस प्रकार, किण्वन कार्बोहाइड्रेट के स्तर में भिंनता एस cerevisiaeके ऊर्जावान चयापचय ड्राइव । यह कागज एक उच्च प्रवाह घातीय खमीर विकास के आधार पर विधि का वर्णन करने के लिए एकाग्रता में परिवर्तन और श्वसन और fermentative चयापचय पर कार्बन स्रोत की प्रकृति के प्रभाव का अनुमान है । एस cerevisiae की वृद्धि एक microplate में मापा जाता है या ६०० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) का निर्धारण करके एक शंकु कुप्पी हिल । फिर, एक वृद्धि वक्र आयुध डिपो बनाम समय है, जो पहचान और घातीय चरण के चयन की अनुमति देता है की साजिश रचने के द्वारा बनाया गया है, और काइनेटिक मापदंडों प्राप्त करने के लिए घातीय वृद्धि समीकरण के साथ फिट है । उच्च दोहरीकरण समय के साथ कम विशिष्ट विकास दर आम तौर पर एक श्वसन विकास का प्रतिनिधित्व करते हैं । इसके विपरीत, कम दोहरीकरण समय के साथ उच्च विशिष्ट विकास दर fermentative वृद्धि का संकेत है । समय और विशिष्ट वृद्धि दर दोहरीकरण के दहलीज मूल्यों इस तरह के गैर-किण्वित कार्बन स्रोतों या किण्वित शर्करा की उच्च सांद्रता के रूप में अच्छी तरह से ज्ञात श्वसन या fermentative शर्तों, का उपयोग कर का अनुमान है । यह प्रत्येक विशिष्ट तनाव के लिए प्राप्त की है । अंत में, परिकलित काइनेटिक मापदंडों दहलीज मूल्यों के साथ तुलना कर रहे हैं स्थापित करने के लिए कि क्या खमीर से पता चलता है fermentative और/या श्वसन विकास. इस विधि का लाभ एक पदार्थ के प्रभाव को समझने के लिए अपने रिश्तेदार सादगी fermentative या श्वसन चयापचय पर यौगिक/ यह महत्वपूर्ण है कि विकास को उजागर करने के लिए एक जटिल और जटिल जैविक प्रक्रिया है; इसलिए, इस विधि से प्रारंभिक डेटा ऑक्सीजन की खपत और किण्वन शोधकार्य के संचय के ठहराव द्वारा पुष्टि किया जाना चाहिए । इस तरह, इस तकनीक यौगिकों की एक प्रारंभिक स्क्रीनिंग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता/पदार्थ है कि परेशान या fermentative या श्वसन चयापचय में वृद्धि हो सकती है ।
Introduction
Saccharomyces cerevisiae वृद्धि शारीरिक और आणविक तंत्र के दर्जनों की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में सेवा की है । विकास मुख्य रूप से तीन तरीकों से मापा जाता है: स्पॉट परीक्षण के लिए सीरियल कमजोर पड़ने, कॉलोनी बनाने इकाई गिनती, और विकास घटता. इन तकनीकों को अकेले या संयोजन में सब्सट्रेट, पर्यावरणीय स्थितियों, म्यूटेंट, और रसायनों की एक किस्म के साथ विशिष्ट प्रतिक्रियाओं या phenotypes की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Mitochondrial श्वसन एक जैविक प्रक्रिया है जिसमें वृद्धि कैनेटीक्स सफलतापूर्वक अज्ञात तंत्र की खोज के लिए लागू किया गया है । इस मामले में, ग्लिसरॉल, स्तनपान, या इथेनॉल के रूप में गैर-किण्वन कार्बन स्रोतों के साथ विकास मीडिया की पूरकता (जो विशेष रूप से mitochondrial श्वसन द्वारा metabolized हैं), एकमात्र कार्बन और ऊर्जा स्रोत के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है के रूप में श्वसन विकास, जो ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण गतिविधि में perturbations का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है1. दूसरी ओर, यह किण्वन के पीछे तंत्र को समझने के लिए एक विधि के रूप में वृद्धि काइनेटिक मॉडल का उपयोग करने के लिए जटिल है ।
किण्वन और mitochondrial श्वसन का अध्ययन Crabtree और Warburg प्रभाव2,3के रूप में कुछ phenotypes के पीछे आणविक तंत्र स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है । Crabtree प्रभाव glycolytic फ्लक्स, mitochondrial श्वसन के दमन की वृद्धि की विशेषता है, और प्राथमिक मार्ग के रूप में किण्वन की स्थापना के लिए किण्वन कार्बोहाइड्रेट की उच्च सांद्रता की उपस्थिति में एटीपी उत्पंन (> ०.८ मिमी)4,5. Warburg प्रभाव चयापचय Crabtree प्रभाव के अनुरूप है, अंतर के साथ किया जा रहा है कि स्तनधारी कोशिकाओं में, किण्वन के मुख्य उत्पाद6स्तनपान कराने वाली है । दरअसल, Warburg प्रभाव कैंसर की कोशिकाओं की एक किस्म द्वारा प्रदर्शित किया जाता है, ग्लूकोज को ट्रिगर और खपत भी ऑक्सीजन7की उपस्थिति में । इस प्रकार, Crabtree प्रभाव में किण्वन के लिए श्वसन से स्विच के आणविक आधार का अध्ययन दोनों (इथेनॉल उत्पादन के लिए) और कैंसर अनुसंधान में संभावित प्रभावों के लिए तकनीकी नतीजों है ।
एस cerevisiae वृद्धि Crabtree और Warburg प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त उपकरण हो सकता है । यह विचार इस तथ्य पर आधारित है कि खमीर घातीय चरण में, केंद्रीय मार्ग एटीपी का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया mitochondrial श्वसन और किण्वन हैं, जो विकास को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं । उदाहरण के लिए, एस cerevisiae के विकास से परिचित एटीपी के समारोह के रास्ते से संबंधित है । एस cerevisiae में, mitochondrial श्वसन लगभग 18 ग्लूकोज अणु प्रति एटीपी अणुओं का उत्पादन, जबकि किण्वन केवल 2 एटीपी अणुओं उत्पंन करता है, इसलिए यह उंमीद है कि विकास दर चयापचय रास्ते के साथ तंग संबंध है एटीपी8उत्पादन । इस संबंध में, जब किण्वन प्रमुख मार्ग एटीपी उत्पन्न करने के लिए है, खमीर कम एटीपी उत्पादन के लिए ग्लूकोज तेज की दर में वृद्धि के लिए क्षतिपूर्ति. इसके विपरीत, खमीर कोशिकाओं द्वारा ग्लूकोज की खपत है कि मुख्य एटीपी स्रोत के रूप में mitochondrial श्वसन का उपयोग कम है । यह इंगित करता है कि यह खमीर के लिए महत्वपूर्ण है निर्धारित कैसे एटीपी उत्पंन किया जाएगा पहले कार्बोहाइड्रेट उपलब्धता भावना । इसलिए, ग्लूकोज उपलब्धता cerevisiae में किण्वन और mitochondrial श्वसन के बीच स्विच में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । ग्लूकोज की उच्च मात्रा की उपस्थिति में, खमीर केंद्रीय मार्ग एटीपी उत्पंन करने के रूप में किण्वन पसंद करते हैं । दिलचस्प है, जब खमीर किण्वन है, विशिष्ट विकास दर अपनी अधिकतम पर बनाए रखा है । दूसरी ओर, ग्लूकोज के निम्न स्तर के तहत, एस cerevisiae mitochondrial श्वसन का उपयोग एटीपी का उत्पादन, कम विकास दर को बनाए रखने. इस प्रकार, ग्लूकोज की एकाग्रता में भिन्नता और अन्य कार्बन स्रोतों का उपयोग fermentative और श्वसन विकास के बीच खमीर की पसंद में परिवर्तन प्रेरित. खाते में घातीय वृद्धि समीकरण के साथ इस तथ्य को लेकर, एक ऐसे दोहरीकरण समय (डीटी) और विशिष्ट विकास दर (µ) के रूप में काइनेटिक मापदंडों के जैविक अर्थ प्राप्त कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, कम µ मूल्यों जब खमीर प्राथमिक मार्ग के रूप में mitochondrial श्वसन का उपयोग करता पाया गया । इसके विपरीत, शर्तों के तहत है कि एहसान किण्वन, उच्च µ मूल्यों पाया गया । यह पद्धति किसी भी रसायनों के संभावित तंत्र को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है किण्वन और एस cerevisiae में mitochondrial श्वसन को प्रभावित ।
इस पत्र का उद्देश्य एक mitochondrial श्वसन या किण्वन पर एक दिया पदार्थ के प्रभाव को परखने के लिए कैनेटीक्स वृद्धि के आधार पर एक विधि का प्रस्ताव है/
Protocol
Representative Results
Discussion
एक लंबे समय के बाद से पारित कर दिया है जे मोनो10 व्यक्त की है कि बैक्टीरियल संस्कृतियों के विकास के अध्ययन के सूक्ष्म जीव विज्ञान की बुनियादी विधि है. आणविक उपकरणों के आगमन के उपयोग और एक तकनीक क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (अनुदान संख्या २९३९४०) और Fundación TELMEX-TELCEL (अनुदान संख्या १६२००५५८५), दोनों को IKOM के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
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