Saccharomyces cerevisiae Eksponentiell vekst Kinetics i Batch kultur analysere Respiratory og Fermentative metabolisme

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å beregne respiratory og fermentative metabolismen av passende Saccharomyces cerevisiae eksponensiell vekst i eksponensiell vekst formelen. Beregning av kinetic parametere tillater screening av påvirkninger av stoffer/forbindelser på gjæring eller mitokondrie åndedrett.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae celler i eksponentiell fase opprettholde sin vekst ved å produsere ATP gjennom gjæring og/eller mitokondrie åndedrett. Fermentable karbon konsentrasjonen styrer hovedsakelig hvordan gjærceller generere ATP; dermed stasjoner variasjonen i fermentable karbohydrater nivåer energisk metabolismen av S. cerevisiae. Dette dokumentet beskriver en høy gjennomstrømming metode basert på eksponentiell gjær vekst å beregne effekten av konsentrasjon endringer og natur karbon kilden på respiratory og fermentative metabolisme. Veksten av S. cerevisiae er målt i en microplate eller ristet konisk kolbe ved å bestemme optisk densitet (OD) på 600 nm. Deretter er en vekstkurve bygget av inntegningsrekkefølgen OD versus tid, som kan identifisere og velge den eksponentielle fasen, og er utstyrt med eksponentiell vekst ligningen som oppnå kinetic parametere. Lav bestemt vekstrater med høyere dobling ganger representerer vanligvis en åndedretts vekst. Derimot vise høyere bestemt vekstrater med lavere dobling ganger fermentative vekst. Terskelverdier for dobling tid og spesifikk vekstrate er beregnet ved hjelp av kjente luftveis- eller fermentative forhold, som ikke-fermentable karbon kilder eller høyere konsentrasjoner av fermentable sukker. Dette oppnås for hver bestemt stamme. Til slutt er beregnet kinetic parameterne sammenlignet med terskelverdier å etablere om gjær viser fermentative og/eller åndedretts vekst. Fordelen med denne metoden er sin relative enkelhet for å forstå virkningene av et stoff/sammensatt på fermentative eller respirasjonssykdommer metabolisme. Det er viktig å understreke at veksten er en intrikate og komplekse biologisk prosess; Derfor må foreløpige data fra denne metoden være bekreftet av kvantifisering av oksygenforbruk og akkumulering av gjæring biprodukter. Dermed, kan denne teknikken bli brukt som en foreløpig screening forbindelser/stoffer som kan forstyrre eller øke fermentative eller respirasjonssykdommer stoffskifte.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae veksten har vært et verdifullt verktøy for å identifisere dusinvis av fysiologiske og molekylære mekanismer. Vekst måles av tre metoder: føljetong fortynninger for spot testing, colony-forming enhet teller og vekst kurver. Disse teknikkene kan brukes alene eller i kombinasjon med en rekke underlag, miljøforhold, mutanter og kjemikalier for å undersøke bestemte svar eller fenotyper.

Mitokondrielt åndedrett er en biologisk prosess der vekst kinetics har vært anvendt for å oppdage ukjent mekanismer. I dette tilfellet kosttilskudd vekst medier med ikke-fermentable karbon kilder som glyserol, laktat eller etanol (som metaboliseres utelukkende av mitokondrie åndedrett), som eneste karbon og energi kilde for å vurdere den åndedretts vekst, som er viktig å oppdage forstyrrelser i oxidative fosforylering aktivitet¹. På den annen side, er det komplisert å bruke vekst kinetic modeller for å tyde mekanismene bak gjæring.

Studiet av gjæring og mitokondrie åndedrett er viktig å belyse molekylære mekanismer bak visse fenotyper som Crabtree og Warburg effekter^2,3. Crabtree effekten er preget av en økning av glycolytic forandring, undertrykkelse av mitokondrie åndedrett, og etableringen av gjæring som den primære sti å generere ATP i nærvær av høye konsentrasjoner av fermentable karbohydrater (> 0,8 mM)^4,5. Warburg effekten er metabolically analog til Crabtree effekten, med forskjellen at i pattedyrceller, hovedproduktet av gjæring er laktat⁶. Faktisk er Warburg effekten utstilt ved en rekke kreftceller, utløser glukose opptak og forbruk selv i nærvær av oksygen⁷. Dermed har studere molekylære grunnlaget for overgangen fra åndedrett til gjæring i Crabtree effekten både bioteknologisk konsekvenser (for etanolproduksjon) og mulige konsekvenser i kreftforskning.

S. cerevisiae vekst kan være et egnet verktøy for å studere virkningene Crabtree og Warburg. Denne ideen er basert på det faktum at i gjær eksponentiell fase, sentrale veier brukt til å produsere ATP er mitokondrie åndedrett og gjæring, som er avgjørende for å opprettholde vekst. For eksempel er veksten av S. cerevisiae nært knyttet til funksjonen av ATP-generering. S. cerevisiae, mitokondrie åndedrett produserer ca 18 ATP molekylene per glukose molekylet, mens gjæring bare genererer 2 ATP molekylene, er derav det forventet at veksten har tette forbindelser med metabolske veier produsere ATP⁸. I denne forbindelse når gjæringen er den viktigste ruten å generere ATP, kompenserer gjær for lite ATP produksjonen ved å øke hastigheten av glukose opptak. Tvert imot, er glukose forbruket gjærceller bruke mitokondrie åndedrett som hovedkilden ATP lav. Dette indikerer at det er viktig for gjær følelse karbohydrater tilgjengelighet før du bestemmer hvordan ATP skal genereres. Derfor glukose tilgjengelighet spiller en viktig rolle i Bytt mellom gjæring og mitokondrie respirasjon i S. cerevisiae. I nærvær av høye mengder glukose foretrekker gjær fermentering som sentrale ruten å generere ATP. Interessant, når gjær er gjæring, beholdes den spesifikk vekstraten på maksimumsnivå. På den annen side, under lave nivåer av glukose produserer S. cerevisiae ATP ved hjelp mitokondrie åndedrett, opprettholde lavere vekstrater. Dermed indusere variasjon i konsentrasjon av glukose og bruk av andre karbon kilder endringer i gjær og preferanse mellom fermentative og luftveier. Ved å ta hensyn til dette faktum med eksponentiell vekst ligningen, kan man få biologiske betydningen av kinetic parametre som dobling tid (Dt) og spesifikk vekstrate (μ). For eksempel ble lavere μ verdier funnet under gjær bruker mitokondrie åndedrett som den primære stien. Tvert imot, under forhold som favoriserer gjæring, ble høyere µ verdier funnet. Denne metoden kan brukes til å måle sannsynlig mekanismer for noen kjemikalier påvirker gjæring og mitokondrie åndedrett i S. cerevisiae.

Målet med denne utredningen er å foreslå en metode basert på vekst kinetics for screening effekten av en gitt stoffet/sammensatt på mitokondrie åndedrett eller gjæring.

Protocol

1. kultur medier og Inoculum forberedelser Forberede 100 mL 2% gjær ekstrakt-pepton-druesukker (YPD) flytende medium (legge 1 g av gjær ekstra, kasein pepton 2 g og 2 g av glukose til 100 mL destillert vann). Dispensere 3 mL media i 15 mL sterilisert konisk rør. Autoclave media i 15 min 121 ° C og 1,5 psi.Merk: Mediene kan lagres i opptil en måned på 4-8 ° C. Vaksinere et konisk rør fylt med 3 mL kule sterilt 2% YPD buljong med 250 μL S. cerevisiae celler i glyserol på 20 ° C. …

Representative Results

Vekst kurver kan brukes å foreløpig forskjellsbehandle respiratory og fermentative fenotyper i S. cerevisiae gjær. Derfor vi utført satsvise kulturer av S. cerevisiae (BY4742) med ulike glukose konsentrasjoner som er rapportert å indusere fermentative vekst: 1% og 2% 10% (w/v)9. Kulturer viser en fermentative fenotypen har en liten lag fase og en eksponentiell fase med høy vekst (figur 1). Etanol, glyserol og la…

Discussion

Lang tid har gått siden J. Monod¹⁰ uttrykt at studiet av veksten av bakteriekulturer er den grunnleggende metoden for mikrobiologi. Ankomsten av molekylære verktøy forsinker forbruket og studie av vekst som en teknikk. Til tross for kompleksiteten i vekst som involverer mange beslektede prosesser, kan dens underliggende mekanismer beskrives ved hjelp av matematiske modeller¹¹. Dette er en robust tilnærming som kan brukes som et supplerende verktøy for å belyse de mest…

Materials

Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures