Presenteren wij gebruik van 2-foton microscopie te plaatsen van een micropipet binnen de urine ruimte Bowman in muizen, 2 fundamentele technieken van renale fysiologie combineren. Gebruik van 2-foton microscopie overwint kritische beperkingen van conventionele microscopie voor micropuncture renale fysiologie studies.
Renale micropuncture en renale 2-photon imaging zijn baanbrekende technieken in de Fysiologie van de nier. Echter micropuncture wordt beperkt door de afhankelijkheid van conventionele microscopie tot oppervlakte Nefron functies, en 2-foton studies zijn beperkt in die zin dat interventies kunnen slechts worden beoordeeld op het orgel, in plaats van het Nefron niveau. Met name zijn micropuncture studies van de glomeruli van muizen aangevochten door de schaarste van de glomeruli van de oppervlakte in muizen. Om deze beperking te oefenen studies van aspirate vanuit de Bowman ruimte in fysiologische muismodellen, ontwikkelden we 2-foton glomerulaire micropuncture. We presenteren een nieuwe chirurgische voorbereiding waarmee laterale toegang tot de nier met behoud van de vereiste verticale imaging kolom voor 2-foton microscopie. Beheer van ultrahoog moleculair gewicht fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran wordt gebruikt voor het renderen van de renale therapieën, en derhalve de glomeruli zichtbaar voor 2-photon imaging. Een quantum dot beklede pipet wordt vervolgens ingevoerd onder stereotactische begeleiding naar een glomerulus geselecteerd uit de diverse waarnaar veel kunnen worden gevisualiseerd in de imaging-venster. In dit protocol bieden wij de details van de voorbereiding, materialen en methoden die nodig zijn om de procedure uit te voeren. Deze techniek faciliteert voorheen onmogelijk fysiologische studie van de nier, inclusief herstel van het filtraat van Bowman ruimte en alle segmenten van het Nefron binnen de imaging diepte, ongeveer 100 µm onder de renale capsule. Druk, last en stroom kunnen alles worden gemeten met de geïntroduceerde pipet. Wij bieden hier, representatieve gegevens van vloeibare chromatografie/massaspectrometrie uitgevoerd op aspirate van Bowman ruimte. Wij verwachten dat deze techniek te hebben de brede toepasbaarheid bij renale fysiologische onderzoek.
Het doel van deze procedure is voor routine micropuncture toegang tot Bowman ruimte en andere glomerulaire structuren in muizen. Micropuncture voor de renale fysiologie studies zijn beperkt tot 1-foton microscopie, die kan alleen afbeelding binnen een paar microns van het oppervlak van de nieren, en die biedt beperkte precisie in de z-dimensie. Omdat muizen hebben enkele oppervlakte glomeruli, het is niet altijd mogelijk om te zoeken van een oppervlak glomerulus door 1-foton microscopie, dus meeste micropuncture studies zijn uitgevoerd in München-Wistar ratten, die talrijker oppervlakte glomeruli hebben. Daarom hebben de voordelen van het werken in muismodellen beperkt gebleven in micropuncture studies,1,,2,3. Recente vooruitgang in de imaging technologieën, met inbegrip van micro-CT4,5, nanoparticle imaging6, en imaging massaspectrometrie7 hebben sterk verbeterd met het bereik van de modaliteiten die van toepassing zijn aan glomerulaire fysiologie, maar Er blijft geen substituut voor de unieke mogelijkheid om te interveniëren en genieten van dat micropuncture biedt. Dus de uitbreiding van het gebruik van micropuncture met behulp van de technieken die hier gepresenteerd wordt verwacht om roman renale fysiologie studies, in het bijzonder, evaluatie van de inhoud van de renale filtraat (d.w.z., metabolomica) en elementaire fysiologie van transgene muizen, zoals metingen van het filtraat druk en opladen, eerder uitgevoerd alleen bij ratten.
Bij deze techniek kan gebruik van 2-foton microscopie Visualisatie en micropipet toegang tot renale structuren tot ongeveer 100 µm onder de renale capsule. Meerdere (5 – 10) glomeruli zijn dus toegankelijk voor micropuncture in elke muis nier dusver beeld. Hoewel deze techniek enkele kenmerken met conventionele renale micropuncture deelt, het was ontworpen DOVO en uitgebreide aanpassingen sinds de conventionele techniek zijn vereist. In dit protocol wij tonen aspiratie van vocht vanuit de Bowman ruimte en voorbeeld Showresultaten van latere analyse met de Spectrometrie van de massa (nanoproteomics)8,9,10,11. Stroomafwaarts gebruik van massaspectrometrie vereist een gespecialiseerde monster voorbereiding werkstroom, die ook hier blijkt.
Presenteren we een methode voor toegang tot Bowman ruimte voor niet-oppervlakte glomeruli in muizen, vergemakkelijkt door 2-foton microscopie. We ontwikkelden deze procedure om een belangrijke beperking van glomerulaire micropuncture, de zeldzaamheid van oppervlakte glomeruli adresseerbare door 1-foton microscopie in muizen, teneinde een experimentele doelstelling, aspiratie van vocht vanuit de Bowman ruimte voor latere analyse. Ontwikkeling en praktijk van deze techniek is gebaseerd op zes cruciale stappen. Ten eerste, de nieuwe chirurgische voorbereiding moet zorgvuldig plaatsvinden zodat de imaging waterkolom wordt niet uitgevoerd uit het dekglaasje aan en het dekglaasje aan strekt zich uit over het gebied van nieren die het doelwit van de pipet. Ten tweede, de glazen pipet gebruikt voor micropuncture moet prijselementen zichtbaar voor 2-foton microscopie, die worden verricht met behulp van quantumdots. Derde, stereotactische techniek is vereist voor het juist positioneren een pipet in Bowman de ruimte in drie dimensies, tot 100 µm onder het oppervlak van de nier. Daarom zijn registreren de coördinaat systemen van de pipet en het podium met precisie kritische stappen. Vierde, zorgvuldige selectie van de glomerulus doelstelling is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat deze toegankelijk is voor de pipet zonder impingement door de nier ondersteunende structuur en imaging kolom. Ten slotte, zorgvuldig moet worden overwogen de analytische stappen de overname procedure te volgen, en volume en timing van de verwerving van vloeibare monsters gepaard moeten gaan met de analyse en aan glomerulaire fysiologie.
We ontwierpen een overname procedure die kan worden uitgebreid tot veel analyses, met inbegrip van traditionele micropuncture eindpunten, zoals vlam fotometrie, ion-gevoelige elektrode metingen of metingen van druk, volume of lading. Bovendien zijn wij van mening dat deze techniek zal worden vatbaar voor nieuwe analytische eindpunten met inbegrip van de polymerase-kettingreactie (misschien na omgekeerde transcriptie voor miRNA) en metabolomica stroomafwaarts van de Spectrometrie van de massa. De speciale wijzigingen tewerkgesteld te vergemakkelijken van massaspectrometrie verdienen extra discussie, en zij sommige beperkingen opleggen. Eerst, hoewel massaspectrometrie hoogst-gevoelig is, de lage eiwitgehalte en het volume van micropuncture monsters maakt analyse van eiwit onder het dynamische bereik van conventionele proteomic exploratie, en daarom vereenvoudigde nanoproteomics waren nodig. 8 , 13 in de tweede plaats voor het optimaliseren van eiwit opbrengst voor vroege testen, we vastgesteld dat 200-300 nL van aspirate noodzakelijk was, maar DOVO filtraat verwerving van dit volume misschien zo lang als 20 minuten van aspiratie vereisen zou wanneer de muis GFR alleen 8-14 nL /min3. Zoals Tojo en Endou aangetoond dat langdurige aspiratie de inhoud van de albumine van vroege proximale zaadvormende vloeistof14 verandert, wij gekozen om gecombineerd meer dan 6 minuten; Dit betekent echter dat onze aspiratie tarief hoger is dan het filtraat instroom tarief. Gebruikers van deze procedure worden aangemoedigd om te overwegen de Fysiologie van de glomerulaire filtratie in hun experimenteel systeem bij het ontwerpen van hun workflow. De Spectrometrie van de massa, een gevoelige techniek, zou worden overweldigd door het signaal van een ingevoerde aardoliedistillaat zoals minerale olie, die vaak in micropuncture gebruikt wordt om te omvatten van het hydraulisch systeem voor aspiratie en isoleren van de segmenten van het Nefron. Dus, we geen gebruik konden maken van minerale olie voor dit doel, of zijn andere gemeenschappelijke gebruik, kwantificering van hoeveelheid nanoliter bereik monsters. In plaats daarvan vullen we het systeem met perfluorodecalin die biologisch inert, massaspectrometrie niet verstoort en gunstige optische kenmerken heeft. Wij geloven dat de beperkingen opgelegd door de perfluorodecalin zijn niet onoverkomelijk en werken aan extra technische innovaties die wij verwachten volumemeting monster en blokkade van de tubulaire segment zal toestaan.
Meeste micropuncture studies zijn uitgevoerd in München-Wistar ratten, waaruit verhoogde aantallen oppervlakte glomeruli, maar deze sterk beperkte fysiologische studie van buisvormige vervoer en andere renale fysiologie wegens het verlies van de fundamentele hulpmiddel van de moleculaire biologie, transgene muizen2,3. Omdat het vergemakkelijkt de micropipet toegang tot de Bowman ruimte in muizen, vermindert de nieuwe techniek daarom deze kritische beperkingen. We hebben deze techniek om toegang van renale filtraat voor proteomic studies met ultragevoelige massaspectrometrie, bekend als de nanoproteomics9te aangenomen. Er zijn echter waarschijnlijk extra toepassingen. Bijvoorbeeld, heeft renale fysiologische studie van gefilterde eiwit sterk geholpen door gebruik van TL traceurs met 2-foton microscopie15,16,17. Toevoeging van micropuncture aan 2-foton microscopie biedt de mogelijkheid van het uitvoeren van single-Nefron fysiologische studie met fluorescerende moleculen, zodat naburige, niet-ingespoten nephrons om te dienen als besturingselementen. Gehoopt wordt dat dit duidelijke uitleg van de noodzakelijke stappen zal toestaan dat brede goedkeuring in laboratoria die reeds uitgerust voor 2-foton microscopie en/of micropuncture. Hoewel het complex, wij hebben deze procedure nu uitgevoerd vele malen en de verfijningen gepresenteerd hierin vertegenwoordigen een stabiel platform voor fysiologische ontdekking.
The authors have nothing to disclose.
NIDDK K08 DK090754 naar NIGMS MPH. P41 GM103493 naar RDS. Dit materiaal is het resultaat van werk (door MPH) die werd gesteund met middelen en het gebruik van faciliteiten in het Portland veteranen zaken Medical Center. De inhoud vertegenwoordigen niet de mening van het Amerikaanse Department of Veterans Affairs of de regering van de Verenigde Staten.
Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
Microinjector | WPI | UMP-3 | |
Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
30 gauge needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |