Den P19 mus embryonale karcinom cellelinje (P19 cellelinje) er almindeligt anvendt til at studere den molekylære mekanisme af neurogenese med stor forenkling i forhold til in vivo-analyse. Her præsenterer vi en protokol for retinoinsyre-induceret neurogenese i P19 cellelinje.
Den P19 cellelinje afledt af en mus embryo-afledte teratocarcinoma har evnen til at differentiere sig i de tre kimlag. I nærværelse af retinsyre (RA), affjedring kultiveret P19 cellelinje er induceret til at differentiere sig til neuroner. Dette fænomen er grundigt undersøgt som en Neuro Genesis model in vitro. Derfor, den P19 cellelinje er meget nyttigt for molekylære og cellulære undersøgelser forbundet med Neurogenesis. Men, protokoller for neuronal differentiering af P19 cellelinje, der er beskrevet i litteraturen er meget komplekse. Den metode, der er udviklet i denne undersøgelse er enkel og vil spille en rolle i belyse de molekylære mekanismer i neuroudviklingsmæssige abnormiteter og neurodegenerative sygdomme.
Under embryonal udvikling omdannes et enkelt celle lag til tre forskellige kimlag1,2,3. For at øge forskningsmulighederne for fænomener, der forekommer in vivo, er generering af tredimensionale aggregater (embryonale organer) blevet udviklet som en bekvem model. Cellulære aggregater dannet på denne måde kan blive udsat for forskellige betingelser, der forårsager Celledifferentiering, som afspejler udviklingen af embryonet4,5. Den P19 murine embryonale karcinom cellelinje (P19 cellelinje) er almindeligt anvendt som en cellulær model for Neuro Genesis undersøgelser in vitro6,7,8. Den P19 cellelinje udviser typiske pluripotente stamcelle funktioner og kan differentiere sig til neuroner i nærværelse af retinsyre (RA) under celle sammenlægning efterfulgt af neurite udvækst under vedtagtige betingelser. Desuden, den udifferentierede P19 cellelinje er også i stand til at danne muskler-og kardiomyocyte-lignende celler under påvirkning af dimethylsulfoxid (DMSO)9,10,11,12.
Mange metoder13,14,15,16 er blevet rapporteret for neuronal differentiering, men metoden er undertiden kompliceret og ikke let at forstå ved kun at læse beskrivelserne. For eksempel kræver protokoller nogle gange en kombination af Dulbecco’s modificerede Eagle medium (DMEM) medium suppleret med en blanding af kalveserum (CS) og føtal bovint serum (FBS)13. Desuden, medier, der anvendes til neuronal udvikling er ofte sammensat af neurobasal og B27 kosttilskud13,14,15,16. Som sådan, eksisterende metoder indeholder kompleksitet i deres forberedelse og vores mål her er at forenkle protokollerne. I denne undersøgelse, vi viste, at DMEM med FBS kan udnyttes til at opretholde P19 cellelinje (DMEM + 10% FBS) samt for neuronal udvikling (DMEM + 5% FBS + RA). Denne forenklede metode til neurogenese ved hjælp af P19 cellelinje giver os mulighed for at studere den molekylære mekanisme af, hvordan neuroner er udviklet. Desuden er forskning i neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom også gennemført ved hjælp af P19 cellelinje17,18, og vi mener, at den metode, der er udviklet i denne undersøgelse vil spille en rolle i at belyse molekylære mekanismer i neuroudviklingsmæssige abnormiteter og neurodegenerative sygdomme.
Her beskriver vi en simpel protokol for neurogenese ved hjælp af P19 Cell line. Selv om mange rapporter er blevet offentliggjort i denne henseende, en detaljeret metodologi for Neuro Genesis induktion ved hjælp af P19 cellelinje forbliver uklar. Desuden har vi udnyttet en simpel høj glukose (4.500 mg/L) DMEM medium med 10% FBS for hele eksperimentet. Dette tillod os at udføre den neurogene eksperiment i en brugervenlig måde og udvide brugen af denne metode for fremtiden.
De mest kritiske …
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelsen blev finansielt støttet af National Science Centre, Polen (Grant nr. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) og KNOW (førende nationale Forskningscenter) videnskabeligt konsortium “sunde dyr-sikre fødevarer”, afgørelse fra ministeriet for videnskab og videregående uddannelse nr. 05-1/KNOW2/2015
6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
Cell Culture Plastics | |||
1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
6-well plate | Corning | CLS3516 | |
Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |