P19 배아 암종을 이용한 신경 발생
1Department of Experimental Embryology, Institute of Genetics and Animal Breeding,Polish Academy of Sciences, 2Department of Regenerative Medicine,Maria Skłodowska-Curie Institute – Oncology Center, 3Department of Genomics and Biodiversities, Institute of Genetics and Animal Breeding,Polish Academy of Sciences
Summary
P19 마우스 배아 암세포주(P19 세포주)는 생체내 분석에 비해 매우 단순화된 신경발생의 분자 기전을 연구하는데 널리 사용된다. 여기서, 우리는 P19 세포주에서 레티노산 유도 신경발생에 대한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
마우스 배아 유래 기형암유래 P19 세포주들은 3개의 세균 층으로 분화하는 능력을 가지고 있다. 레티노산(RA)의 존재에서, 현탁액 배양된 P19 세포주들은 뉴런으로 분화하도록 유도된다. 이 현상은 시험관에서 신경 발생 모델로 광범위하게 조사된다. 따라서, P19 세포주신경발생과 관련된 분자 및 세포 연구에 매우 유용하다. 그러나, 문헌에 기재된 P19 세포주신경 분화를 위한 프로토콜은 매우 복잡하다. 이 연구에서 개발 된 방법은 간단 하 고 신경 발달 이상 및 신경 퇴행 성 질환에 분자 메커니즘을 해명에 역할을 할 것 이다.
Introduction
배아 발달 도중, 단 하나 세포 층은 3개의 개별적인 세균 층 1,2,3로변환됩니다. 생체 내에서 발생하는 현상의 연구 가능성을 높이기 위해 3차원 응집체(배아 체)의 생성이 편리한 모델로 개발되었습니다. 이러한 방식으로 형성된 세포 응집체는 배아4,5의발달을 반영하는 세포 분화를 유발하는 다양한 조건에 노출될 수 있다. P19 뮤린 배아 암종 세포주(P19 세포주)는 일반적으로 시험관내 신경발생 연구를 위한 세포모델로서 사용된다 6,7,8. P19 세포주 전형적인 다능성 줄기 세포 특징을 전시하고 부착 조건하에서 신경 쇠산 다음에 세포 응집 도중 레티노산 (RA)의 존재에 있는 신경으로 분화할 수 있습니다. 더욱이, 미분화 P19 세포주또한 디메틸 설폭사이드(DMSO)9,10,11,12의영향을 받아 근육-및 심근세포 유사 세포를 형성할 수 있다.
많은 방법13,14,15,16은 신경 분화에 대해 보고되었지만, 방법론은 때때로 복잡하고 설명만 읽음으로써 파악하기가 쉽지 않다. 예를 들어, 프로토콜은 때때로 종아리 혈청(CS) 및 태아 소 혈청(FBS)13의혼합물로 보충된 덜베코의 변형 된 독수리 배지 (DMEM) 배지의 조합을 필요로한다. 더욱이, 신경 발달에 사용되는 매체는 종종 신경분과 B27 보충제13,14,15,16으로구성된다. 따라서 기존 메서드에는 준비의 복잡성이 포함되어 있으며 여기서의 목표는 프로토콜을 단순화하는 것입니다. 본 연구에서, 우리는 FBS를 가진 DMEM이 P19 세포주 (DMEM + 10% FBS)뿐만 아니라 신경 발달 (DMEM + 5% FBS + RA)을 유지하는 데 이용될 수 있음을 입증하였다. P19 세포주를 사용하여 신경 발생을 위한 이 단순화한 방법은 우리가 신경세포가 어떻게 개발되는지의 분자 기계장치를 공부하는 것을 허용합니다. 더욱이, 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환에 대한 연구도 P19 세포주17,18을이용하여 진행되고 있으며, 본 연구에서 개발된 방법이 이를 해명하는 데 한 몫을 할 것으로 믿습니다. 신경 발달 이상 및 신경 퇴행성 질환의 분자 메커니즘.
Protocol
1. 문화유지 유지 보수 매체에서 P19 세포주 배양 (Dulbecco의 수정 된 독수리의 배지와 4,500 포도당 의 mg /L 보충 10% FBS, 100 단위 / mL 페니실린 과 100 단위 / mL 연쇄상 구균). 37 °C 및 5 %CO2에서 배양하십시오. 2. 하위 배양 세포 세포가 약 80% 합류에 도달하면, 세포 배양 플라스크(표면적 25 cm2)로부터 소비배지를 제거한다. 칼슘과 마그네슘이…
Representative Results
P19 세포주에서 신경 발생 유도에 대한 프로토콜의 단순화 된 계획은 도1에 제시되어 있다. P19 세포주의 특성을 미분화 상태 및 신경 발생 시 정의하기 위해 RT-PCR(역전사-폴리머라제 연쇄 반응) 방법을 사용하였다. 미분화 P19 세포주들은 유기 양이온/카르니틴 트랜스포터4(Oct4) 및 나노홈박스(Nanog)와 같은 다능성 유전자를 발현하였다. RA?…
Discussion
여기서, 우리는 P19 세포주를 사용하여 신경 발생에 대한 간단한 프로토콜을 기술한다. 많은 보고가 이 점에서 간행되었더라도, P19 세포주를 사용하여 신경 발생 유도를 위한 상세한 방법론은 불분명합니다. 또한, 우리는 전체 실험에 대해 10 % FBS를 가진 간단한 높은 포도당 (4,500 mg / L) DMEM 배지를 이용했습니다. 이를 통해 우리는 사용자 친화적 인 방식으로 신경 성 실험을 수행하고 미래를 위해이 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구 결과는 국립 과학 센터에 의해 재정적으로 지원되었다, 폴란드 (부여 없음. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) 및 KNOW (주요 국가 연구 센터) 과학 컨소시엄 “건강한 동물 – 안전한 식품”, 과학 고등 교육부의 결정 No. 05-1/KNOW2/2015
Materials
| 6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
| Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
| Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
| PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
| Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
| Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
| Cell Culture Plastics | |||
| 1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
| 100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
References
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Cite This Article
Leszczyński, P., Śmiech, M., Teeli, A. S., Zołocińska, A., Słysz, A., Pojda, Z., Pierzchała, M., Taniguchi, H. Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells. J. Vis. Exp. (146), e58225, doi:10.3791/58225 (2019).