Nörojenez P19 embriyonal karsinom hücrelerini kullanarak
Summary
P19 fare embriyonik karsinom hücre hattı (P19 hücre hattı) yaygın olarak büyük basitleştirme ile nörojenez moleküler mekanizmasını incelemek için kullanılan in vivo analizi ile karşılaştırıldığında. Burada, P19 hücre hattında retinoik asit kaynaklı nörogenezi için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Bir fare embriyo türevi teratokarsinoma türetilen P19 hücre hattı üç mikrop katmanları ayırt etme yeteneğine sahiptir. Retinoik asit (RA) varlığında, süspansiyon kültürlü P19 hücre hattı nöronlara ayırt etmek için indüklenir. Bu fenomen bir nörojenez modeli olarak yaygın olarak incelenmiştir. Bu nedenle, P19 hücre hattı neurogenesis ile ilişkili moleküler ve hücresel çalışmalar için çok yararlıdır. Ancak literatürde açıklanan P19 hücre hattının nöronal farklılaşması için protokoller çok karmaşıktır. Bu çalışmada geliştirilen Yöntem basittir ve nörogelişimsel anomalilerde ve nörodejeneratif hastalıklarda moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına bir rol oynayacak.
Introduction
Embriyonal gelişim sırasında, tek bir hücre tabakası üç ayrı germ katmanına dönüştürülür1,2,3. İn vivo oluşan olayların araştırma olanaklarını artırmak için, üç boyutlu toplamları (embriyonik organları) nesil uygun bir model olarak geliştirilmiştir. Bu şekilde oluşan hücresel agregalar, embriyo4,5‘ in gelişimini yansıtan hücre farklılaşmasına neden olan çeşitli koşullara maruz kalabilirler. P19 murine embriyonik karsinom hücre hattı (P19 hücre hattı) yaygın olarak kullanılan bir hücresel model olarak nörojenez çalışmaları için vitro6,7,8. P19 hücre hattı, tipik pluripotent kök hücre özelliklerini sergiler ve hücre toplama sırasında retinoik asit (RA) varlığında nöronların içine yapışabilir koşullar altında nörit gelişiminin ardından ayırt edebilirsiniz. Dahası, farklılaşılmış P19 hücre hattı da dimetil sülfoxid (DMSO)9,10,11,12etkisi altında kas ve kardiyomiyosit benzeri hücreler şekillendirme yeteneğine sahiptir.
Birçok yöntem13,14,15,16 nöronal farklılaşma için bildirilmiştir, ancak metodoloji bazen karmaşık ve sadece açıklamaları okuyarak kavramak kolay değil. Örneğin, protokoller bazen buzağı serum (CS) ve fetal sığır serumu (FBS)13karışımı Ile tamamlayıcı Dulbecco modifiye kartal Orta (dmem) orta bir kombinasyonu gerektirir. Dahası, nöronal gelişim için kullanılan medya genellikle nörobasal ve B27 takviyeleri oluşur13,14,15,16. Bu nedenle, mevcut yöntemler onların hazırlanması karmaşıklık içerir ve burada amacımız protokolleri basitleştirmek için. Bu çalışmada, biz FBS ile DMEM P19 hücre hattı (DMEM + 10% FBS) yanı sıra nöronal gelişim için (DMEM + 5% FBS + RA) korumak için kullanılabilir olduğunu göstermiştir. P19 hücre hattını kullanarak nörogenezi için bu Basitleştirilmiş Yöntem bize nöronların nasıl geliştirildiğini moleküler mekanizması çalışma sağlar. Dahası, Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar üzerinde araştırma da P19 hücre hattı kullanılarak gerçekleştirilir17,18, ve biz bu çalışmada geliştirilen Yöntem aydınlatılmasına bir rol oynayacaktır inanıyoruz nörogelişimsel anomalilerde ve nörodejeneratif hastalıklarda moleküler mekanizmalar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, P19 hücre hattını kullanarak nörojenez için basit bir protokol açıklanmaktadır. Bu konuda birçok rapor yayınlanmasına rağmen, P19 hücre hattını kullanarak nörojenez indüksiyon için ayrıntılı bir metodoloji belirsiz kalır. Dahası, biz tüm deney için 10% FBS ile basit bir yüksek glikoz (4.500 mg/L) DMEM orta kullanılmıştır. Bu bize Kullanıcı dostu bir şekilde nörojenik deney yapmak ve gelecek için bu yöntemin kullanımını genişletmek için izin verdi.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma mali Ulusal Bilim Merkezi, Polonya tarafından destekleniyordu (Grant No. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) ve KNOW (lider Ulusal Araştırma Merkezi) bilimsel konsorsiyum “sağlıklı hayvan-güvenli gıda”, bilim ve yüksek Eğitim Bakanlığı kararı No. 05-1/KNOW2/2015
Materials
| 6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
| Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
| Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
| PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
| Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
| Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
| Cell Culture Plastics | |||
| 1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
| 100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
References
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488 (2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).
- Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).
- ten Berge, D., et al. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway. Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).
- Lin, Y. T., et al. YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway. Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).
- Neo, W. H., et al. MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression. Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).
- Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
- McBurney, M. W., Rogers, B. J. Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns. Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).
- Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).
- Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells. Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).
- Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity. Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).
- Babuska, V., et al. Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation. Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).
- Monzo, H. J., et al. A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells. Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).
- Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity. BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).
- Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells. Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).
- Tsukane, M., Yamauchi, T. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).
- Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation. Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).
- Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
- Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).
- Hamada-Kanazawa, M., et al. Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid. FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).
- Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons. Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).
- Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters. Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).
- MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro. Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).
- Hong, S., et al. Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).
- Wenzel, M., et al. Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells. FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).
- Harada, Y., et al. Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).
- Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum. Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).
- Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line. Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).
