Summary

Neurogenese mit P19 Embryonalkarzinomzellen

Published: April 27, 2019
doi:

Summary

Die p19 Maus embryonale Karzinom-Zelllinie (P19-Zelllinie) ist weit verbreitet für die Untersuchung des molekularen Mechanismus der Neurogenese mit großer Vereinfachung im Vergleich zur In-vivo-Analyse verwendet. Hier stellen wir ein Protokoll zur Retinosäure-induzierten Neurogenese in der P19-Zelllinie vor.

Abstract

Die P19-Zelllinie, die von einem von Einem Mausembryon abgeleiteten Teratokarzinom abgeleitet wurde, hat die Fähigkeit, sich in die drei Keimschichten zu differenzieren. In Gegenwart von Retinsäure (RA) wird die suspensionskultivierte P19-Zelllinie induziert, um sich in Neuronen zu differenzieren. Dieses Phänomen wird als Neurogenese-Modell in vitro ausgiebig untersucht. Daher ist die P19-Zelllinie sehr nützlich für molekulare und zelluläre Studien im Zusammenhang mit Neurogenese. Protokolle zur neuronalen Differenzierung der in der Literatur beschriebenen P19-Zelllinie sind jedoch sehr komplex. Die in dieser Studie entwickelte Methode ist einfach und wird eine Rolle bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen bei neuroentwicklungsbedingten Anomalien und neurodegenerativen Erkrankungen spielen.

Introduction

Während der embryonalen Entwicklung wird eine einzellige Schicht in drei separate Keimschichten1,2,3umgewandelt. Um die Forschungsmöglichkeiten von Phänomenen zu erhöhen, die in vivo vorkommen, wurde die Erzeugung dreidimensionaler Aggregate (embryonale Körper) als praktisches Modell entwickelt. Zellaggregate, die auf diese Weise gebildet werden, können verschiedenen Bedingungen ausgesetzt werden, die eine Zelldifferenzierung verursachen, die die Entwicklung des Embryos4,5widerspiegeln. Die p19 murinische embryonale Karzinom-Zelllinie (P19-Zelllinie) wird häufig als zelluläres Modell für Neurogenese-Studien in vitro6,7,8verwendet. Die P19-Zelllinie weist typische pluripotente Stammzellmerkmale auf und kann sich in Gegenwart von Retinsäure (RA) während der Zellaggregation in Neuronen differenzieren, gefolgt von Neuritenwachstum unter anhaftenden Bedingungen. Darüber hinaus ist die undifferenzierte P19-Zelllinie auch in der Lage, unter dem Einfluss von Dimethylsulfoxid (DMSO)9,10,11,12muskel- und kardiomyozytenähnliche Zellen zu bilden.

Viele Methoden13,14,15,16 wurden für die neuronale Differenzierung berichtet, aber die Methodik ist manchmal kompliziert und nicht leicht zu erfassen, indem man nur die Beschreibungen liest. Beispielsweise erfordern Protokolle manchmal eine Kombination aus Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Medium, ergänzt durch eine Mischung aus Kalbsserum (CS) und fetalem Rinderserum (FBS)13. Darüber hinaus, Medien für die neuronale Entwicklung verwendet werden oft aus neurobasalen und B27 Ergänzungen13,14,15,16. Daher enthalten bestehende Methoden Komplexität in ihrer Vorbereitung und unser Ziel ist es, die Protokolle zu vereinfachen. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass DMEM mit FBS zur Aufrechterhaltung der P19-Zelllinie (DMEM + 10% FBS) sowie zur neuronalen Entwicklung (DMEM + 5% FBS + RA) eingesetzt werden kann. Diese vereinfachte Methode für die Neurogenese mit der P19-Zelllinie ermöglicht es uns, den molekularen Mechanismus zu untersuchen, wie Neuronen entwickelt werden. Darüber hinaus wird die Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit auch mit P19-Zelllinie17,18durchgeführt, und wir glauben, dass die in dieser Studie entwickelte Methode eine Rolle bei der Aufklärung der molekulare Mechanismen bei neuroentwicklungsbedingten Anomalien und neurodegenerativen Erkrankungen.

Protocol

1. Kulturpflege Kultur der P19-Zelllinie im Wartungsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium mit 4.500 mg/L Glukose, ergänzt durch 10% FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 Einheiten/ml Streptomycin). Bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren. 2. Unterkultivierungszellen Wenn Zellen etwa 80 % Zusammenfluss erreichen, entfernen Sie das verbrauchte Medium aus den Zellkulturkolben (Oberfläche 25 cm2). Waschen Sie die Zellen mit 2 ml Phospha…

Representative Results

Das vereinfachte Schema des Protokolls für die Neurogenese-Induktion in Der P19-Zelllinie ist in Abbildung 1dargestellt. Um den Charakter der P19-Zelllinie in einem undifferenzierten Zustand und während der Neurogenese zu definieren, wurde die RT-PCR-Methode (Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion) verwendet. Die undifferenzierte P19-Zelllinie exprimierte die Pluripotenzgene wie organischekation/carnitin transporter4 (Oct4) und Nanog homeo…

Discussion

Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Neurogenese mit der P19-Zelllinie. Obwohl viele Berichte in dieser Hinsicht veröffentlicht wurden, eine detaillierte Methodik für Neurogenese Induktion mit P19-Zelllinie bleibt unklar. Darüber hinaus haben wir ein einfaches hochglukose (4.500 mg/L) DMEM-Medium mit 10% FBS für das gesamte Experiment verwendet. Dies ermöglichte es uns, das neurogene Experiment benutzerfreundlich durchzuführen und die Anwendung dieser Methode für die Zukunft zu erweitern.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Studie wurde vom National Science Centre, Polen (Grant-Nr. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) und KNOW (Leading National Research Centre) Scientific Consortium “Healthy Animal – Safe Food”, Entscheidung des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung Nr. 05-1/KNOW2/2015

Materials

6x DNA Loading Dye EURx E0260-01
Agarose Sigma- Aldrich A9539
cDNA synthesis kit EURx E0801-02
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) Sigma- Aldrich 10236276001 Working concentration: 1 μg/mL
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine Lonza BE12-604Q
Ethanol 99.8% Chempur CHEM*613964202
Fetal Bovine Serum (FBS) EURx E5050-03
MAP2 antibody Thermo Fisher Scientific PA517646 Dilution 1:100
PCR reaction kit EURx E0411-03
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza DE17-602E
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ Lonza BE17- 517Q
Retinoic acid Sigma- Aldrich R2625-50MG  dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) Thermo Fisher Scientific A11034 Dilution 1:500
Skim milk Sigma- Aldrich 1153630500
TBE Buffer Thermo Fisher Scientific B52
Triton-X 100 Sigma- Aldrich T8787-100ML
Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without  Ca2+, Mg2+,with Phenol Red biosera LM-T1720/500
Cell Culture Plastics
1 mL Serological Pipettes Profilab 515.01
10 mL Serological Pipettes Profilab 515.10
100 mm dish dedicated for suspension culture Corning C351029
15 mL centrifuge tubes Sigma- Aldrich CLS430791-500EA
5 mL Serological Pipettes Profilab 515.05
6-well plate Corning CLS3516
Cell culture flasks, surface area 25 cm2 Sigma- Aldrich CLS430639-200EA

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Leszczyński, P., Śmiech, M., Teeli, A. S., Zołocińska, A., Słysz, A., Pojda, Z., Pierzchała, M., Taniguchi, H. Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells. J. Vis. Exp. (146), e58225, doi:10.3791/58225 (2019).

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