ניתוח של סינתזת חלבונים Epididymal והפרשת
Summary
כאן, אנו מדווחים על לוקליזציה immunofluorescence של dynamin כדי להמחיש את הפרוטוקולים עבור זיהוי חלבונים בסעיפים epididymal העכבר פרפין-מוטבע ואלו של קו מונצחים תא epididymal (mECap18). אנו מתארים גם את הפרוטוקולים עבור הבידוד של חלבונים הפרשה של נוזל epididymal והן תאים ממוזגים מדיה.
Abstract
יותרת האשך בתרבית של מפיק אחד הנוזלים intraluminal המורכבים ביותר של כל בלוטה אנדוקרינית על מנת לתמוך את ההבשלה פוסט-האשכים ואחסון של spermatozoa. המורכבות כזה מתעוררת עקב הפעילות הפרשה ואת ספיגת ידע משולב של תאי אפיתל רירית. כאן, אנו מתארים את הטכניקות לניתוח של סינתזת חלבונים epididymal והפרשת על-ידי התמקדות משפחת חלבונים המודל של dynamin (DNM) mechanoenzymes; GTPases גדולים שיש להם פוטנציאל להסדיר אירועים סחר ממברנה דו כיווני. לצורך המחקר של ביטוי חלבונים ברקמת epididymal, נתאר מתודולוגיה חזקים immunofluorescence תיוג של חלבונים היעד בסעיפים פרפין-מוטבע, זיהוי עוקבות של ההתפלגות המרחבי של חלבונים אלה באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence. אנו מתארים גם מתודולוגיה אופטימיזציה בידוד ואפיון של exosome כמו שלפוחית, הידועה בשם epididymosomes, אשר מופרשים לתוך לומן epididymal להשתתף בתקשורת המערכת עם התבגרות תאי זרע. כמו בגישה המשלימה, נתאר גם גילוי immunofluorescence של חלבונים היעד בתור תא העכבר מונצחים SV40 caput epididymal אפיתל (mECap18). יתר על כן, נדון בכלי השירות של שורת תאים mECap18 כדגם מתאים במבחנה בה לחקור את ויסות פעילות הפרשה epididymal. לענין זה, אנו מתארים את הדרישות culturing עבור התחזוקה של הקו תא mECap18 ושימוש של משטרי עיכוב תרופתי סלקטיבית כי הם מסוגלים להשפיע על הפרופיל שלהם חלבון הפרשה. האחרון הם העריכו בקלות באמצעות קציר של בינוני תרבות ממוזגים, ריכוז חלבונים המופרש בעזרת חומצת חומץ טריכלור/אצטון משקעים וניתוח עוקבות שלהם דרך מרחביות-דף ו- immunoblotting. אנו טוענים כי שיטות אלה משולבים מתאימים לניתוח של חלבון epididymal חלופי מטרות כהקדמה קביעת שלהם תפקיד פונקציונלי זרע התבגרות ו/או אחסון.
Introduction
Spermatozoa של כל זני יונקים לרכוש את הפוטנציאל להצגת תנועתיות מתקדמת קדימה, כדי להפרות ביצית במהלך את התקדמותם. בכמאה ממושכת דרך יותרת האשך, אזור המערכת הגברי צינור במיוחד האשכים, אשר ייתכן מאוד מיוחדים 7-14 ימים כדי לנווט (תלוי בזן)1. בשל עיבוי קיצוני של כרומטין האבהי שפיכת הרוב המכריע של הציטופלסמה שמלווה את cytodifferentiation של spermatozoa בתוך האשכים, התפקודית עוקבות שלהם מונעת באופן בלעדי על ידי האינטראקציה שלהם עם microenvironment epididymal. סביבה זה, בתורו, נוצר על ידי הפעילות הפרשה ואת ספיגת ידע של סומה epididymal הבטנה ומציג רמה יוצאת דופן של קטע-קטע וריאציה1. כך, המקטעים הפעילים ביותר במונחים של סינתזת חלבונים והפרשת הם אלה הממוקמים בחלק הפרוקסימלית של יותרת האשך (כלומר, caput ו קורפוס)2. פעילות זו מראות לפרופיל תפקודי של spermatozoa, עם תחילת הראשונה תאים להצגת ההיכר של כשירות תפקודית (כלומר., תנועתיות מתקדמת ואת היכולת לאגד zona solubilized-חומצה glycoproteins) הבאים שלהם מעבר דרך יותרת האשך caput3. תכונות אלה פונקציונלי להמשיך לפתח לפני שהגיע רמות אופטימלית כמו הזרע להגיע דיסטלי epididymal המקטע (תסמונת), שבה הן מאוחסנות במצב של השבתה הדרגתית לקראת השפיכה. היווצרות ואת התחזוקה של מאגר אחסון זה הזרע קשורה באופן אינטימי גם האפיתל הציפוי, אשר תסמונת נשלטת על ידי פעילות ספיגת ידע חזק4,5. למרות הבדלים אנטומיים כבר דווח על6,7,8, כגון חלוקת העבודה שינגן מופיע להיות מאפיין של יותרת האשך שמשותף בין רוב זני יונקים למד עד כה, לרבות משלנו9,10. אכן, מנקודת מבט קליני, הוא מוכר שאת תפקוד epididymal גורם תרומה חשובה האטיולוגיה של גורם זכרי פוריות11, ובכך הדגשת החשיבות להבנת ברגולציה של רקמה מיוחדת זו.
לכן זה מצער כי ההבנה שלנו של פיזיולוגיה epididymal, ואת המנגנונים המווסתים את השלבים רציפים של זרע התבגרות ואחסון בתוך רקמה זו, יישארו לפתור באופן מלא. בין הגורמים התורמים, הגבלת ההתקדמות במחקר epididymal הם המורכבות הכוללת של רקמה זו וידע מנגנון רגולטורי לשלוט microenvironment luminal שלה. מבחינה אנטומית, אנו יודעים כי מעבר ההבחנה בין מקטעי caput, קורפוס, תסמונת, יותרת האשך נחלקים עוד מספר אזורי (איור 1 א’), אחד המופרדים באמצעות septa12 , המאופיינת פרופילים נפרדים של הגן/חלבון הביטוי13,14,15,16,17,18. ואכן, על בסיס נתונים היסטוריים תעתיק פרופיל של ביטוי גנים סגמנטלי של יותרת האשך, דווחו כ 6 ו 9 אזורים epididymal נפרדים במודלים עכבר, חולדה, בהתאמה19,20. כאלה המורכבות משקף ככל הנראה את ההרכב של סומה epididymal, אפיתל pseudostratified הכוללת סוגי תאים שונים רבים; כל שונות ביחס לפעילותם לשפע, הפצה, הפרשה/ספיגת ידע לאורך דרכי. כך, התאים העיקריים הם עד כה הנפוץ ביותר תא epididymal סוג המהוות למעלה מ- 80% של כל תאי אפיתל. בהתאם לכך, תאים עיקריים אחראים עיקר ביוסינטזה והפרשת חלבון epididymal5. לעומת זאת, האוכלוסייה התא ברורה לדרג כסוג התא השני הנפוץ ביותר בטווח סומה epididymal, מעורבים בעיקר סלקטיבית ספיגת רכיבי luminal, את לחומצי הזה microenvironment5. הוספת רמה נוספת של מורכבות, אנדרוגנים וגורמים אחרים lumicrine ממוצא האשכים להפעיל שליטה דיפרנציאלית על כל אחד מסוגי התאים epididymal בהתאם שלהם מיצוב לאורך מערכת.
למרות המגבלות שהוטלו על ידי כאלה המורכבות, התקדמות משמעותית ממשיכות להתבצע תוך פתרון הבסיס מכניסטית של פונקציה epididymal. מפתח מחקרים אלה כבר היישום של אסטרטגיות מתקדמות ספקטרומטר מסה כדי ליצור רשימות מלאי בהיקף נרחב של פרוטאום epididymal, במשולב עם ניתוח מפורט של חלבונים בודדים מתוך סקרים אלה הראשונית. איור של גישה זו הוא שלנו אפיון האחרונות של משפחת DNM mechanoenzymes העכבר דגם21. ההתעניינות DNM הראשונית שלנו הייתה מונעת על ידי פעילות כפולה צימוד של exo – ותהליכים endocytotic. בונים על תצפיות אלה, היינו מסוגלים להפגין כי שלושה איזופורמים הקנוני של DNM (DNM1 – DNM3) הם מאוד שבאה לידי ביטוי האשך העכבר וממוקמים כראוי כדי למלא את תפקידי רגולטוריות הפרשת חלבון וקליטה21 . יתר על כן, היינו יכולים להבחין בבירור כל isoform DNM על בסיס לוקליזציה הסלולר וסלולריות תת שלהם, ובכך רומז שיש ברשותם משלימים, לעומת פעילות עודפת, בתוך האפיתל epididymal21.
כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ניסיוני המועסקים לצורך המחקר של DNM ביטוי האשך עכבר עם תקווה כי מידע זה מצא יישום רחבות אפיון חלופי חלבונים epididymal, ובכך לתרום שלנו ההבנה של הפונקציה של יסוד חשוב זה של מערכת הרבייה הגברית. באופן ספציפי, אנו מתארים את פיתוח מתודולוגיה חזקים immunofluorescence תיוג של חלבונים היעד בסעיפים epididymal פרפין-מוטבע, זיהוי עוקבות של ההתפלגות המרחבי של חלבונים אלה באמצעות immunofluorescence מיקרוסקופ. בהמשך, ואנחנו מתעדים שלנו לאחרונה ממוטבת פרוטוקולים22 עבור בידוד ואפיון של epididymosomes; שלפוחית קטנה, כמו exosome מהווים רכיבי מפתח של הפרופיל הפרשה epididymal, מופיעים להחזיק תפקיד חשוב בקידום זרע התבגרות23. כמו בגישה המשלימה, אנו מתארים גם גילוי immunofluorescence של חלבונים היעד ב קו תא אפיתל epididymal (mECap18) caput מונצחים העכבר ושימוש של משאב זה כמודל שבה לחקור ברגולציה של epididymal הפרשה בפעילות חוץ גופית בתוך.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים אלה לשלב את השימוש של Bouin קבוע רקמת epididymal ולגופה פרפין הטבעה ופרוטוקולים סטנדרטיים אופטים. פתרון לשבועיים של Bouin כוללת תערובת של פורמלדהיד, חומצה picric, חומצה אצטית, עם כל רכיב יש פונקציה ספציפית ומשלימים. לפיכך, פורמלדהיד מגיב עם ראשי אמינים כדי ליצור חלבון חוצה קישורים, חומצה picric לאט …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להכיר את הבריאות הלאומיים ואת רפואי מחקר המועצה של אוסטרליה פרויקט גרנט APP1103176 על התמיכה של עבודה זו.
Materials
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
References
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
- Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
- Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
- Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. . The epididymis. 3, (2006).
- Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
- Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
- Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
- Turner, T. T. De Graaf’s thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
- Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
- Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
- Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
- Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
- Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
- Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
- Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
- Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
- Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
- Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
- Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
- Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
- Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
- Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
- Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
- Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
- Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
- Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D., Daniels, J. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. , 86-116 (1971).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , (2001).
- Elkjær, M. -. L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
- Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
- Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
- Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
- Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
- Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
- Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
- Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
- Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
- Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
- Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
- Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
- Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell’Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
- Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).
