精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析
Summary
パラフィン埋め込まれたマウス精巣のセクションで蛋白質の検出と精巣細胞の不死化線 (mECap18) のためのプロトコルを説明するダイナミンの蛍光抗体法により局在を報告する.また精巣上体液やエアコン携帯メディアから分泌蛋白質の隔離のためのプロトコルについて述べる。
Abstract
哺乳類の精巣上体は後精巣の成熟と精子のストレージをサポートするためにすべての内分泌腺の最も複雑な管腔内流体のいずれかを生成します。このような複雑さは、粘膜上皮細胞の結合分泌・吸収活動のため発生します。ここでは、ダイナミン (そこ) mechanoenzymes; のモデル蛋白質家族に焦点を当てた精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析手法について述べる大規模な低分子量 g 蛋白質双方向膜人身売買イベントを規制する可能性があります。精巣組織の蛋白質の表現の検討, 蛍光ラベリング パラフィン埋め込まれたセクションの標的タンパク質とを介してこれらのタンパク質の分布の後続の検出のための堅牢な方法論について説明します。蛍光顕微鏡検査。分離と小胞、成熟精子細胞と細胞間のコミュニケーションに参加する精巣の内腔に分泌する epididymosomes として知られているようなエキソソームの特性の最適化手法についても述べる。補完的なアプローチとして SV40 不死化マウス頭精巣上皮 (mECap18) の細胞ラインのターゲット蛋白質の蛍光検出について述べる。さらに、精巣の分泌活性の調節を探索するために適した体外モデルとして mECap18 細胞株の有用性について論じる。この目的のため培養 mECap18 細胞株およびその分泌タンパク質プロファイルに影響を与えることができる選択的薬理学的阻害療法の使用メンテナンス要件をについて説明します。後者は、SDS-PAGE および免疫ブロット経由で彼らの後の分析、トリクロロ酢酸/アセトンの沈殿物によって分泌された蛋白質の濃度条件培の収穫を使って容易に評価。我々 は、これらの結合方法が精子成熟および/またはストレージの機能的役割の決定へのプレリュードとして代わりとなる精巣上体蛋白質ターゲットの分析に適していると主張します。
Introduction
すべての哺乳類の種の精子を取得前方の進歩的な運動を表示して精巣上体、可能性があります男性の精巣余分なダクト システムの専門性の高い領域での長期にわたる降下中に卵子を受精する可能性7-14 日 (種) によって移動するを取る1。父系クロマチンの極端な凝縮と精巣内精子の分化に伴う細胞質の多数の放出のための後続の機能的成熟はの相互作用によってのみ駆動します。精巣微小環境。この環境は、ライニング精巣上体相馬の分泌・吸収活動によって作成され、ターンでは、セグメント バリエーション1の例外的なレベルが表示されます。したがって、タンパク質の合成と分泌の面で最もアクティブなセグメント、精巣上体 (すなわち、頭とコーパス)2の近位部にあります。このアクティビティ ミラー機能の能力の特徴を表示する最初の細胞と精子の機能のプロファイル (すなわち、進歩的な運動とするソーナの酸可溶性糖タンパク質に結合する機能) 次の。3頭精巣上体を通過。これらの機能的な属性は精子射精のための準備で静止状態で格納される前記遠位精巣上体セグメント (バーニャカウダ) に到達、最適なレベルに達する前に開発し続けます。形成とこの精子の貯蔵貯蔵所の維持は、馬尾の強い吸収活動4,5によって支配される粘膜上皮とも密接に結びついて。このような地域ごとの分業が哺乳類の種の大半の間で共有される精巣上体の特徴的な表示されます解剖学的違いは、報告された6,7、8をされていますが、私たち自身の9,10を含む日付を検討した.確かに、それ臨床的観点からは、精巣機能障害男性因子不妊11、こうしてこの専門組織の規制を理解することの重要性を強調の病因に重要な貢献を作ることが知られています。
したがって、精巣上体の生理学の私達の理解と精子の成熟とこの組織内のストレージの連続相を調節するメカニズムが完全に解決するに残っているは残念です。貢献の要因の間で精巣上体の研究の進歩に制限は、この組織の全体的な複雑さとその内腔の微小環境を規制制御メカニズムの知識です。解剖学的, 我々 は知っている、頭、コーパスと馬尾のセグメントの区別を超えて精巣上体 (図 1 a) いくつかのゾーンに細分されることができます、各隔壁12で区切られた、遺伝子/タンパク質の離散分布によって特徴付けられる式13,14,15,16,17,18。確かに、詳細な精巣上体における分節遺伝子発現の転写プロファイリング、に基づいてできるだけ多く 6 と 9 の精巣上体ゾーンはマウスおよびラットのモデルは、それぞれ19,20で報告されています。このような複雑さはおそらく精巣上体の相馬、偽重層上皮を構成する多数の異なったセルタイプ。 の組成を反映しています。管の長さに沿って豊富、配布および分泌・吸収活動に関してはそれぞれ異なります。したがって、主細胞は、これまでで、最も豊富な精巣細胞型を構成するすべての上皮細胞の 80% 以上。したがって、主細胞、精巣上体のタンパク質生合成と分泌5の大半を担当。対照的に、精巣上体の相馬内で 2 番目の最も豊富なセル型としてランク付けする、明細胞の人口主に内腔のコンポーネントの選択的吸収と5本の微小環境の酸性化に関与しています。男性ホルモンおよび精巣の起源の他の lumicrine の要因を出す管に沿って自分の位置によってこれらの精巣細胞型の差動制御の複雑さの別の層を追加するには。
このような複雑さの制限にもかかわらず重要な侵害は精巣機能のメカニズムの基礎を解決するのに行われ続けます。これらの研究のキーは、これらの初期調査の中から選択した個々 のタンパク質の詳細な分析とタンデムで精巣上体のプロテオームの幅広く在庫を確立する高度な質量分析戦略のアプリケーションをされています。このアプローチの例が、そこマウス モデル21で mechanoenzymes 族の私たちの最近の評価。そこで我々 の初期の関心は、エキソおよびエンドサイトーシス プロセスのカップリングにそのデュアル アクションによって支えられていた。そこ (DNM1 – DNM3) の 3 つの標準的なアイソ フォームがマウス精巣上体で高発現し、タンパク質の分泌と吸収21 における調節的役割を果たすために適切に配置されていることを示すことができたこれらの観察結果を踏まえ、.また、できた明確に各細胞と細胞内局在、に基づいてそこにアイソ フォームを区別するために示唆精巣上皮21内の冗長、アクティビティではなく、相補的な所有しています。
ここでは、採用希望この情報が精巣上体、代替タンパク質の特性でより広いアプリケーションを見つけるに貢献するためにマウスの精巣上体におけるそこ発現の研究のため実験方法について述べる、男性の生殖管のこの重要な要素の機能を理解します。具体的には、堅牢な蛍光ラベリング パラフィン精巣切片の標的タンパク質と蛍光抗体法によってこれらの蛋白質の分布の後続の検出手法の開発について述べる顕微鏡検査。我々 はさらに私たち最近最適化されたプロトコルの22の単離と解析 epididymosomes; を文書化します。小さなエキソソームのような小胞精巣の分泌プロファイルの重要な要素を構成する、精子成熟23を促進する上で重要な役割を保持するために表示されます。補完的なアプローチとしても述べる不死化マウス頭精巣上皮 (mECap18) の細胞ラインのターゲット蛋白質の蛍光検出および精巣上体の規制を探索するためのモデルとしてこのリソースの使用分泌活動体外。
Protocol
Representative Results
Discussion
これらの研究には、パラフィン包埋、セクショニングの標準プロトコルにさらされていたブアン固定精巣組織の使用が組み込まれています。ブアン固定液には、具体的かつ相補的な機能を持つ各コンポーネントにホルムアルデヒド、ピクリン酸と酢酸の混合物が装備されています。したがって、タンパク質の架橋結合を形成する第一級アミンと反応してホルムアルデヒドが、ピクリン酸はゆ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、この作業をサポートするため国立保健医療研究評議会のオーストラリア プロジェクト助成金 APP1103176 を認識したいと思います。
Materials
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
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