Détection et isolement des corps apoptotiques de haute pureté
Summary
Un flux de travail par écoulement cytometry ou prime de centrifugation est conçu pour détecter, quantifier et isoler les corps apoptotiques d’un échantillon d’apoptotic à haute pureté.
Abstract
Corps apoptotiques (ApoBDs), les microvésicules et les exosomes sont les principaux membres de la famille de vésicule extracellulaire, avec ApoBDs étant un des plus grand type. Il a été proposé que les ApoBDs peuvent aider clairance cellulaire ainsi que communication intercellulaire via trafic biomolécules. Les approches conventionnelles utilisées pour l’identification et l’isolement des ApoBDs sont souvent limités par l’absence de quantification précise et pureté de l’échantillon faible. Nous décrivons ici un flux de travail pour confirmer l’induction de l’apoptose, valider la formation ApoBD et isoler ApoBDs à haute pureté. Aussi nous décrire et comparer cellule activée par fluorescence triant (FACS) et les approches de centrifugation différentielle basée à isoler ApoBDs. En outre, la pureté des ApoBDs isolées sera confirmée en utilisant un préalablement établir écoulement cytometry-base coloration et méthode d’analyse. Pris ensemble, à l’aide de l’approche décrite, THP-1 monocyte apoptose et apoptose cellulaire démontage a été induite et validé, et ApoBD provenant des monocytes THP-1 ont été isolés à une pureté de 97 à 99 %.
Introduction
L’apoptose, une forme de mort cellulaire programmée, bien étudiée est nécessaire pour maintenir l’homéostasie physiologique et éliminer les cellules potentiellement nocifs dans le corps humain1. Après l’induction de l’apoptose, cellules apoptotiques (ApoCells) peuvent subir une série de changements morphologiques et démonter dans petites vésicules membranaires appelées ApoBDs. Dans l’ensemble, ce processus est connu comme le démontage de cellules apoptotiques et peut être divisé en 3 étapes distinctes, basées sur la morphologie2,3. Étape 1 (membrane plasmique blebbing) se caractérise par la formation de structures ressemblant à des ballons sur la surface des cellules appelées bulles4,5. Étape 2 (formation de protrusion apoptotiques) comprend la formation de protrusions membranaires longue comme apoptopodia, apoptopodia-perles et microtubules pointes6,7,8. Enfin, étape 3 (formation ApoBD) comprend la fragmentation des protubérances apoptotic et/ou ApoCells pour générer ApoBDs6,9. Résultats antérieurs ont suggéré un rôle de ApoBDs en facilitant le dégagement de cellules apoptotiques et médiation communication intercellulaire. Par exemple, il est proposé que la fragmentation d’un ApoCell en ApoBDs peut produire des petits morceaux de « petits » qui pourrait être facilement enlevés en entourant les phagocytes2,10,11. En outre, ApoBDs pourrait contenir une série de molécules comme l’ADN, l’ARN et des protéines qui peuvent être victimes de la traite aux cellules environnantes afin de faciliter la communication de cellule-cellule12,13,14. Pour fonctionnellement étudier ces processus, il est essentiel de confirmer trois paramètres clés, y compris (i) la validation d’induction de l’apoptose et de la formation de ApoBD, (ii) l’isolement du ApoBDs et (iii) la confirmation de la pureté de la ApoBD.
Auparavant, un certain nombre de méthodes, y compris cytométrie de flux et de microscopie électronique ont été utilisé pour étudier l’apoptose et ApoBDs15,16,17,18. Cependant, ApoBD détection et quantification sont souvent difficiles, voire négligé. Par exemple, l’apoptose plus couramment utilisé d’axée sur la cytométrie en flux dosage emploie annexine V (A5, une protéine qui se lie l’externalisés ‘ manger-me’ signal phosphatidylsérine (PtdSer)) et l’acide nucléique stain (PI) de l’iodure de propidium19. Cependant, en utilisant cette combinaison universelle tache, analyse suppose qu’il y a seulement trois types de sous-ensembles de cellules (cellules viables, ApoCells et cellules nécrosées) dans l’échantillon. En outre, bien que considéré comme « un étalon-or » par de nombreux chercheurs de l’apoptose, des analyses de cytométrie en flux et l’analyse ultérieure des données exclut souvent ApoBDs par une première étape de blocage en sélectionnant les événementsintermédiaires-haute FSC/SSC. Par conséquent, nous avons récemment mis au point un essai de cytométrie en flux roman A5 et TO-PRO-3, une autre tache d’acides nucléique qui peut être sélectivement absorbé par la caspase 3/7-activé pannexine 1 (PANX1) canaux7,20. Comme les caspases induite par 3 PANX1 activation précède PtdSer exposition aux premiers stades de l’apoptose, TO-PRO-3 taches différentiellement apoptotiques et nécrotiques cellules. En outre, cette approche combinée avec notre roman gating stratégie inclut des événements tout acquis au cours de l’analyse des données et ainsi, six des sous-ensembles de cellule/particule sont identifiés, notamment : (i) des cellules viables (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5faible , TO-PRO-3faible), (ii) A5– ApoCells précoce (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5basse, TO-PRO-3intermédiaire), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5haute , TO-PRO-3intermédiaires), les cellules nécrotiques (iv) ou ApoCells fin (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5haute, TO-PRO-3élevé), (v) ApoBDs (FSC/SSCfaible, A5intermédiaire, TO-PRO-3faible / intermédiaires) et (vi) débris (FSC/SSCfaible, A5basse, TO-PRO-3bas)20. Notre approche met l’accent sur l’importance d’analyser tous les sous-ensembles de cellules/particules et, plus important encore, la séparation des ApoBDs des cellules et des débris de20. Ainsi, cette approche montre une technique efficace pour valider l’induction de l’apoptose et ApoBD formation en même temps.
Traditionnellement, les ApoBDs ont été isolés par le biais de diverses méthodes de centrifugation différentielle par laquelle ApoBDs peut être séparé de cellules ou d’autres vésicules extracellulaires basés sur la densité. Cependant, ces méthodes de centrifugation sont souvent limités par la pureté de la ApoBD faible, absence d’une étape de quantification pour confirmer la pureté de l’échantillon, et/ou incapacité à séparer les cellules spécifiques au type ApoBDs17,21,22. Par conséquent, nous avons récemment développé deux approches, une base de FACS et une nouvelle approche axée sur la centrifugation différentielle peut être couplée à notre méthode de cytométrie en flux précédemment établie pour valider l’induction de l’apoptose et échantillon de pureté23. ApoBD isolation grâce à notre approche axée sur les FACS peut enrichir ApoBDs jusqu’à 99 % de pureté et peut être couplée avec une variété d’anticorps spécifiques à un type cellulaire à isoler ApoBDs des populations de cellules mixtes, les échantillons de tissus et les fluides corporels,23. En outre, notre approche révisée de centrifugation différentielle démontre une méthode efficace pour isoler ApoBDs à > 90 % pureté23.
Dans cet article, nous décrivons en détail notre procédure expérimentale afin de valider l’induction de l’apoptose et détecter et quantifier la formation ApoBD. Les flux de travail de ApoBD d’isolation à l’aide de méthodes centrifugation différentielles et axés sur les FACS est également élaborés et comparés. Les données représentatives démontrent que la méthodologie décrite fournit un outil de pointe efficace pour de futures études de ApoBD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Depuis sa première description dans les années 1950, le domaine de l’apoptose a progressé nettement, devenir un domaine de recherche important. Malgré l’intérêt général et des efforts considérables, certains aspects de l’apoptose, en particulier la formation d’ApoBDs, n’ont pas été bien étudiés en raison de l’absence de méthodologies appropriées. Citons notamment la limitation dans le suivi de la progression de l’apoptose et de la formation de ApoBD simultanément à l’aide de la cytométri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cela a fonctionné a été pris en charge par des subventions de santé nationale et Conseil de recherches médicales (GNT1125033 et GNT1140187) et Australian Research Council (DP170103790) à I.K.H.P.
Materials
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | – | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | – | – | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | – | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | – | – | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | – | |
| FlowJo 8.8.6 software | – | – | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | – |
References
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