Algılama ve yalıtım için yüksek saflıkta apoptotik organlarının
Summary
Akış Sitometresi veya diferansiyel Santrifüjü kullanarak bir iş akışı tespit etmek, ölçmek ve apoptotik vücutlarından apoptotik örneği yüksek saflıkta yalıtmak için geliştirilmiştir.
Abstract
Apoptotik organları (ApoBDs), microvesicles ve exosomes anahtar hücre dışı vezikül ailesiyle en büyük türü olan ApoBDs üyesidir. ApoBDs hücre izni hem de hücreler arası iletişim yoluyla kaçakçılığı biomolecules yardımcı olabilir teklif edildi. Kimlik ve ApoBDs yalıtım için kullanılan geleneksel yaklaşımlar genellikle doğru miktar ve düşük örnek saflık eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Burada, apoptozis indüksiyon onaylamak, ApoBD formasyonu doğrulamak ve ApoBDs için yüksek saflıkta yalıtmak için bir iş akışı açıklanmaktadır. Ayrıca anahat ve floresan aktif hücre (FACS) sıralama ve ApoBDs izole etmek için fark Santrifüjü dayalı yaklaşımlar karşılaştırın. Ayrıca, izole ApoBDs saflığı kullanarak teyit edilecek bir daha önce akış sitometresi tabanlı boyama ve analitik yöntem kurmak. Birlikte, açıklanan yaklaşım kullanılarak yapılan THP-1 monosit apoptozis ve apoptotik hücre sökme indüklenen ve doğrulanmış ve THP-1 monosit oluşturulan ApoBD 97-%99 saflık için izole edildi.
Introduction
Apoptozis, programlı hücre ölümü iyi çalışılmış bir form fizyolojik homeostazı korumak ve insan vücudu1içindeki zararlı olma olasılığı bulunan hücreleri kaldırmak için gereklidir. Apoptozis indüksiyon sonra apoptotik hücreler (ApoCells) morfolojik değişiklikler bir dizi tabi ve ApoBDs olarak adlandırdığı küçük membran bağlı veziküller sökmeye. Genel olarak, bu işlem apoptotik hücre sökme bilinir ve morfoloji2,3dayalı 3 farklı adımları ayrılabilir. Adım 1 (plazma zarı blebbing) blebs4,5olarak bilinen hücre yüzeyinde balon benzeri yapıların oluşumu ile karakterizedir. Adım 2 (apoptotik çıkıntı oluşumu) uzun membran çıkıntılar sivri6,7,8apoptopodia, boncuklu-apoptopodia ve Mikrotubul gibi oluşumu içerir. Son olarak, adım 3 (ApoBD oluşumu) parçalanma apoptotik çıkıntılar ve/veya ApoBDs6,9oluşturmak için ApoCells içerir. Önceki bulgular ApoBDs apoptotik hücre temizleme yardım ve hücreler arası iletişim arabuluculuk rolü tavsiye ettiler. Örneğin, bir ApoCell parçalanma ApoBDs içine kolayca fagositler2,10,11çevreleyen tarafından kaldırılmış olabilir küçük ‘ısırık büyüklüğünde’ parçalar oluşturabilir önerilmiştir. Ayrıca, ApoBDs biomolecules DNA, RNA ve proteinler, hücre-hücre iletişim12,13,14kolaylaştırmak için çevredeki hücreleri insan ticareti gibi bir dizi olabilir liman. Bu işlemlerin işlevsel olarak araştırmak için (i) doğrulama apoptosis indüksiyon ve ApoBD oluşumu, ApoBDs izolasyonu (II) ve (III) onay ApoBD saflık da dahil olmak üzere üç anahtar parametreleri onaylamak için hayati önem taşımaktadır.
Daha önce birkaç yöntem akış sitometresi ve Elektron Mikroskopisi gibi apoptozis ve ApoBDs15,16,17,18eğitim için kullanılmaktadır. Ancak, ApoBD algılama ve miktar zor veya gözden çoğu kez. Örneğin, rutin olarak kullanılan akış sitometresi tabanlı apoptosis V annexin istihdam tahlil (A5, externalized bağlar bir protein ‘ yemek-bana ‘ sinyal Fosfatidilserin (PtdSer)) ve nükleik asit leke propidium iyodür (PI)19. Ancak, bu evrensel leke bileşimini kullanarak, analiz hücre alt kümeleri (hücrelerin, ApoCells ve nekrotik hücre) örnek yalnızca üç tür vardır varsayar. Ayrıca, apoptozis için pek çok araştırmacı tarafından “altın standart” olarak kabul rağmen akış sitometresi deneyleri ve sonraki veri analizi kez FSC/SSCOrta-yüksek olaylar seçerek bir ilk gating adım adım ApoBDs dışarıda tutar. Bu nedenle, biz son zamanlarda A5 ve kime-PRO-3 kullanarak bir roman akış sitometresi tahlil geliştirdik, seçmeli olarak caspase 3/7-aktif pannexin 1 (PANX1) tarafından alınabilir başka bir nükleik leke7,20kanal. Caspase 3 kaynaklı PANX1 harekete geçirmek PtdSer pozlama apoptosis erken aşamada önce gelir gibi kime-PRO-3 differentially apoptotik ve nekrotik hücre lekeleri. Buna ek olarak, bu yaklaşım strateji çoğunluğuna bizim roman ile birlikte veri çözümlemesi sırasında tüm alınan olayları içerir ve dahil olmak üzere altı hücre/parçacık alt kümeleri sonuç olarak tanımlanır: (i) hücrelerin (FSC/SSCOrta/yüksek, A5düşük , Kime-PRO-3düşük), (II) A5– erken ApoCells (FSC/SSCOrta/yüksek, A5düşük, kime-PRO-3Ara), (III) A5+ ApoCells (FSC/SSCOrta/yüksek, A5yüksek , Kime-PRO-3Ara), (IV) nekrotik hücre veya geç ApoCells (FSC/SSCOrta/yüksek, A5yüksek, kime-PRO-3yüksek), (v) ApoBDs (FSC/SSCdüşük, A5Ara, kime-PRO-3düşük / ara) ve (vi) enkaz (FSC/SSCdüşük, A5düşük, kime-PRO-3düşük)20. Bizim yaklaşım tüm hücreler/parçacık alt kümeleri ve daha da önemlisi, ApoBDs ayrılık hücreleri ve enkaz20analiz önemini vurgular. Böylece, bu yaklaşım aynı anda apoptozis ve ApoBD oluşumu indüksiyon doğrulamak için verimli bir tekniği gösteriyor.
Geleneksel olarak, ApoBDs nereye ApoBDs hücreleri veya yoğunluğu dayalı diğer ekstraselüler veziküller ayrılabilir diferansiyel Santrifüjü yaklaşımlar çeşitli aracılığıyla izole edilmiştir. Ancak, tür Santrifüjü yöntemler genellikle düşük ApoBD saflık,-sizlik çekmek-in örnek saflık ve/veya hücre türüne özgü ApoBDs17,21,22ayrı yetersizlik onaylamak için bir miktar adım tarafından sınırlıdır. Bu nedenle, biz son zamanlarda iki yaklaşım, FACS tabanlı ve hangi Apoptozis ve örnek saflık23indüksiyon doğrulamak için bizim daha önce kurulan akış sitometresi yöntemi ile birleştiğinde yeni fark Santrifüjü temelli bir yaklaşım geliştirdik. ApoBD yalıtım FACS tabanlı yaklaşımımız ile % 99 saflık için yukarı ApoBDs zenginleştirmek ve hücre türüne özgü antikor ApoBDs karma hücre popülasyonlarının, doku örnekleri ve vücut sıvıları23izole etmek için çeşitli ile birleştiğinde. Ayrıca, bizim gözden geçirilmiş fark Santrifüjü yaklaşım ApoBDs için yalıtmak için verimli bir yöntem gösteriyor > % 90 saflık23.
Bu yazıda, apoptozis indüksiyon, doğrulamak ve algılamak ve ApoBD oluşumu ölçmek için deneysel bir işlem bizim biz ayrıntılı olarak tarif. FACS tabanlı ve fark Santrifüjü tabanlı yöntemleri kullanarak ApoBD yalıtım iş akışları da özenli ve karşılaştırıldığında. Temsilcisi veri açıklanan yöntemi gelecekteki ApoBD çalışmalar için etkili bir üstün araç sağlar gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
1950’lerin başlarında açıklamasını beri apoptozis alanında belirgin, bir önde gelen araştırma alanı haline ilerlemiştir. Geniş ilgi ve geniş çabalarına rağmen apoptozis, özellikle ApoBDs, oluşumu bazı yönlerini de uygun yöntemleri eksikliği nedeniyle incelenmiştir değil. Bunlar özellikle belgili tanımlık sınırlama apoptosis ilerleme ve ApoBD oluşumu aynı anda geleneksel akış sitometresi A5/PI analiz ve ApoBD yalıtım kirleri kullanarak izleme içerir. Biz son zamanlarda metodolojik Bu e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bunun işe yaradığına I.K.H.P. için Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (GNT1125033 ve GNT1140187) ve Avustralya Araştırma Konseyi (DP170103790) hibe tarafından desteklenmiştir
Materials
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | – | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | – | – | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | – | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | – | – | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | – | |
| FlowJo 8.8.6 software | – | – | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | – |
References
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
- Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
- Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
- Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
- Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
- Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
- Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
- Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
- Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
- Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
- Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
- Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
- Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
- Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
- Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
- Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
