검색 및 Apoptotic 몸 높은 순도 절연
Summary
교류 cytometry 또는 차등 원심 분리를 사용 하 여 워크플로 검색, 계량 및 apoptotic 시체는 apoptotic 샘플 고 순도 분리 개발 된다.
Abstract
Apoptotic 시체 (ApoBDs), microvesicles 및 exosomes ApoBDs 가장 큰 종류 중 하나 되 고 함께 세포 외 기 가족의 주요 회원입니다. 그것은 ApoBDs 밀매 생체 세포 통신으로 셀 정리 도움이 될 수 있습니다 제안 되었습니다. 식별 및 ApoBDs의 격리에 사용 하는 기존의 접근은 종종 정확한 정량화 및 낮은 샘플 순도의 부족에 의해 제한 됩니다. 여기, 우리는 apoptosis 유도 확인 하 고, ApoBD 형성, 검증 순도를 ApoBDs를 분리 하는 워크플로 설명 합니다. 우리 또한 약술 하 고 형광 활성화 된 세포 (FACS) 정렬 및 ApoBDs을 기반으로 하는 차등 원심 분리 접근 비교 것입니다. 또한, 고립 된 ApoBDs의 순도 확인 될 것 이다 사용 하는 이전 교류 cytometry 기반 얼룩이 지 고 분석 방법 확립. 기술된 접근을 사용 하 여 함께 찍은 THP 1 monocyte apoptosis와 apoptotic 세포 분해 했다 유도 검증, 그리고 THP 1 monocytes에서 생성 된 ApoBD 97-99%의 순수성에 고립 되었다.
Introduction
Apoptosis, 프로그램 된 세포 죽음의 잘 공부 형태를 생리 적 항상성 유지 하 고 인체1내에서 잠재적으로 유해한 세포를 제거 해야 합니다. Apoptosis 유도 후 apoptotic 세포 (ApoCells) 일련의 형태학 적 변화를 받아야 하 고 ApoBDs 되 나 작은 막 도약 vesicles로 분해 수 있습니다. 전반적으로,이 과정 apoptotic 세포 분해로 알려져 있으며 형태2,3에 따라 3 가지 단계로 나눌 수 있습니다. 단계 1 (플라즈마 멤브레인 blebbing) 풍선 모양의 구조 blebs4,5로 알려진 세포 표면에 형성 특징 이다. 단계 2 (apoptotic 돌출 형성) apoptopodia, 파란색 apoptopodia 및 microtubule 스파이크6,,78등 긴 막 돌출의 형성을 포함합니다. 마지막으로, 3 단계 (ApoBD 형성) apoptotic 돌출 ApoBDs6,9를 생성 하는 ApoCells의 파편을 포함 한다. 이전 연구 결과 apoptotic 세포 클리어런스를 방 조 하 고 세포 통신을 중재에 ApoBDs의 역할을 제안 했다. 예를 들어 ApoBDs에는 ApoCell의 분열 식 세포2,10,11을 둘러싼에 의해 쉽게 제거 될 수 있는 작은 ‘ 입 크기 ‘ 조각 생성 수는 제안 합니다. 또한, ApoBDs DNA, RNA 및 단백질, 셀 통신12,,1314를 촉진 하기 위하여 주변 셀에는 인신 매매 수 등 생체의 일련을 항구 수 있습니다. 기능적으로이 프로세스를 조사, apoptosis 유도 및 ApoBD 형성의 유효성 검사 (i), (ii) ApoBDs, 절연 및 (iii) ApoBD 순수성의 확인을 포함 하 여 세 가지 주요 매개 변수를 확인 하는 생명 이다.
이전에, cytometry 등 전자 현미경 검사 법 방법의 수 ApoBDs15,16,,1718apoptosis를 공부 하 고 사용 되었습니다. 그러나, ApoBD 검출 및 정량화는 종종 어려운 또는 간과. 가장 일상적으로 사용 되는 흐름 cytometry 기반 apoptosis 고용 annexin V를 시험 하는 예를 들어, (A5, 단백질은 외부화는 ‘ 먹고-나 ‘ 신호 phosphatidylserine (PtdSer))과 핵 산 얼룩 propidium 요오드 화물 (PI)19. 그러나,이 범용 얼룩 조합을 사용 하 여 분석 가정 샘플에서 셀 하위 (가능한 셀, ApoCells 및 회 저 성 세포)의 3 종류가 있습니다. 또한, 비록 apoptosis에 대 한 많은 연구자에 의해 “금 표준”으로 간주, cytometry 분석 실험 및 후속 데이터 분석은 종종 FSC/SSC중간-높 은 이벤트를 선택 하는 초기 제어 단계를 통해 ApoBDs을 제외. 따라서, 우리는 최근에 a 5와 TO-프로-3를 사용 하 여 새로운 흐름 cytometry 분석 결과 개발, caspase 3/7-활성화 pannexin 1 (PANX1)에 의해 선택적으로 촬영 될 수 있는 또 다른 핵 얼룩 채널7,20. Caspase 3 유도 PANX1 활성화 apoptosis의 초기 단계에서 PtdSer 노출 앞로 TO-프로-3 차동 apoptotic 및 회 저 성 세포를 얼룩. 또한, 전략 게이팅 우리의 소설과 결합 된이 접근 데이터 분석 중 모든 획득된 이벤트를 포함 하 고 그 결과, 6 셀/입자 하위 집합 식별 됩니다, 포함 하 여: (i) 가능한 셀 (FSC/SSC중간/높은, A5낮은 , TO-프로-3낮은), (ii) A5– 초기 ApoCells (FSC/SSC중간/높은, A5낮은,중간에-프로-3), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSC중간/높은, A5높은 ,중간에-프로-3), (iv) 회 저 성 세포 또는 늦은 ApoCells (FSC/SSC중간/높은 A5높은,높은TO-프로-3), (v) ApoBDs (FSC/SSC낮은, A5중간, TO-프로-3낮은 중간 /), 그리고 (vi) 파편 (FSC/SSC낮은,낮은A5, TO-프로-3낮은)20. 우리의 접근 방식은 모든 셀/입자 하위 집합 및, 더 중요 한 것은, 세포와 파편20에서 ApoBDs의 분리 분석의 중요성을 강조 한다. 따라서,이 방법은 apoptosis와 ApoBD 형성의 유도 동시에 확인 하는 효율적인 기법을 보여 줍니다.
전통적으로, ApoBDs는 ApoBDs 셀 또는 밀도에 따라 다른 세포 외 소포에서 분리 될 수 있다 그것에 의하여 차별 원심 분리 방식의 다양 한 격리 되었습니다. 그러나, 이러한 원심 분리 방법은 종종 낮은 ApoBD 순수성, 샘플 순도 및 셀 형식 관련 ApoBDs17,,2122분리를 확인 정량화 단계의 부족에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리 최근 두 가지 방법, FACS 기반 및 새로운 차등 원심 분리-기반 접근 apoptosis와 샘플 순도23의 유도 확인 하기 위해 우리의 이전 설립된 흐름 cytometry 방법으로 결합 될 수 있는 개발. FACS 기반 접근을 통해 ApoBD 절연 99% 순도, 최대 ApoBDs을 풍요롭게 수 있습니다 하 고 혼합된 셀 인구, 조직 샘플 및 체액23에서 ApoBDs을 셀 유형 특정 항 체의 다양 한 결합 될 수 있다. 또한, 우리의 개정된 차등 원심 분리 방식을 보여줍니다 ApoBDs를 분리 하는 효율적인 방법 > 90% 순도23.
이 종이, 우리가 자세히 설명 apoptosis 유도, 유효성을 검사 하 고 검색 하 고 ApoBD 형성 계량 우리의 실험 절차. FACS 기반 및 차등 원심 기반 방법을 사용 하 여 ApoBD 절연 워크플로 또한 정교 하 고 비교. 대표적인 데이터 설명된 방법론 미래 ApoBD 연구에 대 한 효과적인 첨단 도구를 제공 합니다 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이후 1950 년대에 있는 그것의 초기 설명, apoptosis의 분야 전진 했다 현저 하 게, 저명한 연구 분야를 되 고. 광범위 한 관심과 광범위 한 노력에도 불구 하 고 apoptosis, 특히 ApoBDs의 대형에에서의 하지 되었습니다 잘 공부 적절 한 방법론의 부족. 특히 추적 apoptosis 진행과 동시에 전통적인 cytometry A5/PI 분석 및 ApoBD 격리의 불순물을 사용 하 여 ApoBD 형성에 제한이 포함 됩니다. 최근 접근 방법론 이러한 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
일이 I.K.H.P. 국가 건강 및 의료 연구 위원회 (GNT1125033 및 GNT1140187) 및 호주 연구 협의회 (DP170103790)에서 교부 금에 의해 지원 되었다
Materials
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | – | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | – | – | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | – | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | – | – | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | – | |
| FlowJo 8.8.6 software | – | – | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | – |
References
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