Gjenkjennings- og isolering av apoptotisk organer til høy renhet
Summary
En arbeidsflyt ved hjelp av flyt cytometri eller differensial sentrifugering er utviklet for å oppdage, kvantifisere og isolere apoptotisk organer fra en apoptotisk prøve å høy renhetsgrad.
Abstract
Apoptotisk organer (ApoBDs), microvesicles og exosomes er de viktigste medlemmene av ekstracellulære vesicle familien ApoBDs er en av de største type. Det har blitt foreslått at ApoBDs kan hjelpe celle klaring samt intercellulære kommunikasjon gjennom menneskehandel biomolecules. Konvensjonelle tilnærminger brukt for identifisering og isolering av ApoBDs er ofte begrenset av mangel på nøyaktig kvantifisering og lav eksempel renhet. Her beskriver vi en arbeidsflyt for å bekrefte induksjon av apoptose, validere ApoBD formasjon og isolere ApoBDs til høy renhetsgrad. Vi vil også disponere og sammenligne fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) og differensial sentrifugering basert tilnærminger til å isolere ApoBDs. Videre renheten av isolerte ApoBDs vil bli bekreftet ved hjelp av en tidligere etablere flyt cytometri-basert flekker og analysemetode. Tatt sammen med beskrevet tilnærming, THP-1 monocytt apoptose og apoptotisk celle demontering ble indusert og godkjent, og ApoBD generert fra THP-1 monocytter var isolert til renhet av 97-99%.
Introduction
Apoptose, en godt studert form for programmert celledød, er nødvendig for å opprettholde fysiologiske homeostase og fjerne skadelige celler i den menneskelige kropp1. Etter induksjon av apoptose, kan apoptotisk celler (ApoCells) gjennomgå en rekke morfologiske endringene og Demonter til små membran-bundet blemmer kalt ApoBDs. Total, denne prosessen kalles apoptotisk celle demontering og kan deles inn i 3 forskjellige trinn basert på morfologi2,3. Trinn 1 (plasma membran blebbing) er preget av dannelsen av ballong-lignende strukturer på celleoverflaten kalles blebs4,5. Trinn 2 (apoptotisk protrusion formasjon) inkluderer dannelsen av lang membran utstikkende deler som apoptopodia, beaded apoptopodia og microtubule toppene6,7,8. Til slutt, trinn 3 (ApoBD formasjon) inneholder fragmentering av utstikkende deler som apoptotisk eller ApoCells til å generere ApoBDs6,9. Tidligere funn har foreslått en rolle i ApoBDs hjelpe apoptotisk celle klarering og formidling intercellulære kommunikasjon. For eksempel er det foreslått at fragmentering av en ApoCell til ApoBDs kan generere små bite-sized biter som lett kan fjernes ved omgir phagocytes2,10,11. Videre kan ApoBDs havn en rekke biomolecules som DNA, RNA og proteiner, som kan være smugles til omkringliggende celler å lette celle-celle kommunikasjon12,13,14. Funksjonelt undersøke disse prosessene, er det viktig å bekrefte tre nøkkelparametere inkludert (i) validering av apoptose induksjon og ApoBD formasjon, (ii) isolering av ApoBDs, og (iii) bekreftelse av ApoBD renhet.
En rekke metoder inkludert flowcytometri og elektronmikroskop har tidligere blitt brukt apoptose og ApoBDs15,16,17,18. Men er ApoBD påvisning og måling ofte vanskelig eller oversett. For eksempel rutinemessig brukes flyt cytometri-baserte apoptose analysen sysselsetter annexin V (A5, et protein som binder de externalized ‘ spise-meg ‘ signal fosfatidylserin (PtdSer)) og nukleinsyre flekken propidium iodide (PI)19. Imidlertid bruker denne universelle flekken kombinasjonen, forutsetter analyse at det finnes tre typer celle undergrupper (levedyktig cellene, ApoCells og nekrose) i utvalget. Videre om betraktet som “en gull-standard” av mange forskere for apoptose, flowcytometri søk og påfølgende analyse utelukker ofte ApoBDs gjennom et første gating trinn å velge FSC/SSCMiddels høy hendelser. Derfor har vi nylig utviklet en roman flyt cytometri analysen A5 og til-PRO-3, en annen kan flekken som kan selektivt tas av caspase 3/7-aktivert pannexin 1 (PANX1) kanaler7,20. Som caspase 3-indusert PANX1 aktivisering foran PtdSer eksponering på et tidlig stadium av apoptose, flekker til-PRO-3 ulikt apoptotisk og nekrose celler. I tillegg denne tilnærmingen kombinert med vår romanen gating strategi omfatter alle ervervet hendelser under dataanalyse og resultatet seks cellen/partikkel delsett er identifisert, inkludert: (i) levedyktige cellers (FSC/SSCMiddels/høy, A5lav , Til-PRO-3lav), (ii) A5– tidlig ApoCells (FSC/SSCMiddels/høy, A5lav, til-PRO-3Middels), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCMiddels/høy, A5høy , Til-PRO-3Middels), (iv) nekrotisk celler eller sen ApoCells (FSC/SSCMiddels/høy, A5høy, til-PRO-3høy), (v) ApoBDs (FSC/SSClav, A5mellomliggende, til-PRO-3lav / mellomliggende), og (vi) rusk (FSC/SSClav, A5lav, til-PRO-3lav)20. Vår tilnærming understreker viktigheten av å analysere alle celler/partikkel delsett og, enda viktigere, separasjon av ApoBDs fra celler og rusk20. Derfor viser denne tilnærmingen en effektiv teknikk for å validere induksjon av apoptose og ApoBD formasjon samtidig.
ApoBDs har tradisjonelt vært isolert gjennom en rekke differensial sentrifugering tilnærminger der ApoBDs kan skilles fra celler eller andre ekstracellulære blemmer basert på tetthet. Men er slike sentrifugering metoder ofte begrenset av lave ApoBD renhet, mangel på en kvantifisering steg å bekrefte eksempel renhet, og/eller manglende evne til å skille celle type-spesifikk ApoBDs17,21,22. Derfor har vi nylig utviklet to tilnærminger, en FACS-basert og en ny differensial sentrifugering tilnærming som kan kombineres med våre tidligere etablert flyt cytometri metode for å validere induksjon av apoptose og prøve renhet23. ApoBD isolasjon via våre FACS tilnærming kan berike ApoBDs opp til 99% renhet og kan kombineres med en rekke celle type-spesifikk antistoffene isolere ApoBDs fra blandet celle populasjoner, vevsprøver og kroppsvæsker23. Videre vår reviderte differensial sentrifugering tilnærming demonstrerer en effektiv metode for å isolere ApoBDs til > 90% renhet23.
I dette papiret beskrive vi i detalj vår eksperimentelle prosedyren validere apoptose induksjon, og for å oppdage og kvantifisere ApoBD formasjon. ApoBD isolasjon arbeidsflyter med FACS-basert og differensiell sentrifugering-baserte metoder er også utarbeidet og sammenlignet. Representant dataene viser at beskrevet metodikken gir et effektivt banebrytende verktøy for fremtidig ApoBD studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Siden tidlig beskrivelsen i 1950, har feltet apoptose avansert betydelig bli en fremtredende forskningsområde. Tross av bred interesse og omfattende arbeid, har visse aspekter av apoptose, spesielt dannelsen av ApoBDs, ikke blitt godt studert skyldes mangel på passende metoder. Disse inkluderer spesielt begrensning i å spore apoptose progresjon og ApoBD formasjon samtidig ved hjelp av den tradisjonelle flowcytometri A5/PI analyse og urenheter ApoBD isolasjon. Vi har nylig utviklet metoder for å løse disse metodologi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Health og Medical Research Council (GNT1125033 og GNT1140187) og australske forskningsråd (DP170103790) til I.K.H.P.
Materials
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | – | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | – | – | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | – | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | – | – | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | – | |
| FlowJo 8.8.6 software | – | – | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | – |
References
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
- Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
- Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
- Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
- Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
- Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
- Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
- Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
- Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
- Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
- Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
- Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
- Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
- Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
- Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
- Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
