Fare Lentiviral Gene lazer destekli teslim yumurta döllenmiş
Summary
Döllenmiş yumurta fare ve erken sahne embriyolar zona pelusida, gen teslim karşı bir bariyer oluşturur bir glikoprotein matris tarafından korunmaktadır. Bu makalede, zona lentiviral vektörler ile embriyonik hücreler transduce ve transgenik fareler oluşturmak için bir lazer ile perfore için bir iletişim kuralı.
Abstract
Lentiviruses gen teslim memeli hücreleri için verimli vektörleridir. İletim, lentiviral genom stabil ana bilgisayar kromozom kurulmuştur ve döl için geçirilir. Böylece, onlar istikrarlı hücre hatları oluşturulması, vivo içinde teslim edilmesi göstergeleri ve iletim transjenik hayvanlar oluşturmak için tek hücre döllenmiş yumurta için ideal vektörleridir. Ancak, fare yumurta döllenmiş ve erken sahne embriyolar zona pelusida, lentiviral gen teslim karşı bir bariyer oluşturur bir glikoprotein matris tarafından korunmaktadır. Lentiviruses zona nüfuz için fazla büyüktür ve genellikle viral parçacıkların mikroenjeksiyon perivitelline boşluğu, zona ve embriyonik hücreleri arasında boşluk içine tarafından teslim edilir. Çok yetenekli teknoloji ve özel ekipman gereksinimini fare embriyo gen teslim için lentiviruses kullanımını en aza. Bu makalede bir lazer ile zona perfore tarafından fare döllenmiş yumurta permeabilizing için bir iletişim kuralı. Lazer-delikli embriyolar için herhangi bir hasara yol açmaz ve lentiviruses embriyonik hücreler gen teslim için erişim sağlar. Transduced embriyoların blastosist in vitro geliştirmek ve pseudopregnant farelerde implante transgenik pups geliştirmek. Bu protokol için kullanılan etkili ve kullanımı kolay lazerdir. Stabil lentiviruses tarafından teslim genler fare embriyonik hücreleri birleştirmek ve germline nakle engel vardır. Hiçbir embriyolardan gerektirir transgenik fareler oluşturulması ve mikroenjeksiyon döllenmiş yumurta için alternatif bir yöntem bu.
Introduction
Bu yöntem embriyonik hücreleri tarafından lentiviruses gen teslim için erişilebilir hale getirmek için fare döllenmiş yumurta zona pelusida permeabilizing için ayrıntılı yönergeler sağlar. Lentiviruses doğa verimli gen teslim edilmek üzere memeli hücreleri tarafından tasarlanmıştır. Hücrelerin bölünmesi ve bölme bulaştırmak ve lentiviral genom onların ana bilgisayar kromozom1entegre. Lentiviral konak hücre aralığını kolayca VSV-G protein2geniş tropism nedeniyle vesicular Stomatit virüs glikoprotein (VSV-G), ile rekombinant lentivirus pseudotyping tarafından genişletilir. İletim lentiviral genler stabil entegre ve ana bilgisayar kromozomlarını transjenik hayvanlar oluşturmak için ideal bir araç oluşturma bir parçası olarak dile getirdi. Eğer erken sahne embriyonik hücreler için teslim lentiviral genom çoğaltılır ve tüm organizmada dile getirdi. Lentiviral iletim fare, sıçan, tavuk, bıldırcın üretimi için yol açmıştır ve3,4,5,6,7 transgenics diğer türler arasında domuz. Lentiviral gen teslim, tipik yöntemi ancak, yetenekli teknisyenler ve özel ekipman erken sahne embriyo Kapsüller zona pelusida engeli aşmak için gerektirir. Bu yöntem genel amacı lentiviral gen teslim kolaylaştırmak için bir lazer kullanarak zona permeabilize nasıl tarif etmektir.
Memeli yumurta döllenme ve çevresel etkileşimleri8,9döllenmiş yumurta polyspermy karşı korumak için takip sertleşir zona pelusida tarafından çevrili. Zona embriyoların blastosist yumurtadan kadar uzak embriyonik hücreleri lentiviruses tutan bir bariyer oluşturur. Kültürlü fare yumurta kapağı 4 gün sonra döllenmiş ve damızlık pups içine normal gelişim için önce pseudopregnant fareler içine implante olması gerekir. Bu nedenle, iletim için perivitelline boşluğu, zona ve embriyonik hücreleri arasında boşluk içine zona üzerinden tarama önce lentiviruses microinjected.
Zona pelusida kez vitro fertilizasyon insan yumurta döllenme oranı10artırmak için kaldırılır. Ancak, fare zona pelusida kimyasal kaldırılması olumsuz fare embriyo gelişimi etkiler ve embriyonik hücreleri11,12‘ ye zararlıdır. Diğer yöntemler gen teslim edilmek üzere fare döllenmiş yumurta DNA doğrudan mikroenjeksiyon içine hücre çekirdeği13tarafından zona pelusida engeli aşmak. Pronuclear mikroenjeksiyon genler embriyolar için teslim etkili bir yoludur. Ancak, bu yana her embriyo mikroenjeksiyon için tek tek bir yerde tutulur, uygulama zahmetli ve zaman alıcı bir acemi kullanıcı için olabilir.
Elektroporasyon ve fotoporasyon gibi diğer yöntemleri geçici için yararlı ve kısa vadeli gen teslim fare için döllenmiş yumurta14,15,16. Bu yöntemler, CRISPR-Cas9 bileşenleri ve adlandırılan teslim etmek için yaygın olarak kullanılır. Ancak, genlerin Elektroporasyon ve fotoporasyon teslim transgenics oluşturmak için verimli bir şekilde kullanılamaz. Delinmiş fare epididim toplanan sperm hücreleri de lentiviruses tarafından transduced ve vitro fertilizasyon için transjenik hayvanlar17,18,19, üretmek için kullanılan 20.
Bu protokol için fare embriyo lentiviral gen teslim bir lazer kullanarak zona permeabilizing tarafından yönetilir. XYClone lazer vitro fertilizasyon21 ve embriyonik kök hücre22tarımı için yardımcı olarak geliştirilmiştir. Bu kurulumu basit ve kullanımı kolay küçük bir aparat var. Bir kez bir mikroskobunun yüklü, o bir objektif lens yer kaplar ve eşlik eden yazılımın mikroskop göz mercekleri ile bakarken Lazer hedefleyen için izin verir ( iletişim kuralıbkz: Bölüm 3). Bir kez zona XYClone lazer tarafından delikli, lentiviruses gen teslim23Kültür Medya içine tanıttı olabilir. Birden fazla lentiviruses aynı anda birkaç genlerin kromozom birleşme için teslim etmek için kullanılabilir.
Bu iletişim kuralı yalıtmak nasıl anlatacağım ve kültür fare yumurta döllenmiş, zona pelusida perforasyon için lazer kullanılışını ve fare embriyonik hücreleri iletim tarafından lentiviruses gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lentiviruses onların ana bilgisayar genom entegre yeteneği onları istikrarlı gen teslim için ideal bir vektör yapar. Lentiviral vektörel çizimler ilâ 8.5 kilobaz çifti (kbp) hücre özgü veya indüklenebilir rehberleri, seçim işaretleri veya floresan moieties ağırlayacak genetik malzemesinin taşıyabilir. Anonim genomik malzeme onların ana bilgisayar genom parçası olarak çoğaltabilir ve hızlı veya istediğiniz zaman noktalarda devre dışı bırakmak için düzenlenir. Bu vektörler gen ifadesi çe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Ulusal Enstitüsü Sağlık (NIH), Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) Intramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir. Dr Robert Petrovich ve Dr Jason Williams için kritik okuma el yazması ve faydalı tavsiyeler için minnettarız. Biz de kabul ve Dr. Bernd Gloss, altını gizleme çekirdek, akış sitometresi tesis, floresans mikroskobu ve görüntüleme merkezi ve NIEHS Karşılaştırmalı Tıp şube tesislerin teknik katkılarından dolayı teşekkür ederiz istiyorum. Bay David Goulding Karşılaştırmalı Tıp şubesinden ve Bayan Lois Wyrick görüntüleme Merkezi, bize fotoğraf ve illüstrasyonlar ile sağlamak için NIEHS teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , (2007).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).
- McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
- Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).
- Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).
- Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
- Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).
- Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).
- Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).
- Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).
- Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).
- Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
- Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).
- Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
- Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).
- Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006 (2), (2006).
- Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
