Laser-assisted lentivirale Gene levering aan muis bevruchte eieren
Summary
Muis bevruchte eieren en vroege fase embryo’s worden beschermd door de zona zitten, een glycoproteïne-matrix die een barrière tegen levering van het gen vormt. Dit artikel beschrijft een protocol voor de zona perforeren met een laser transduce van embryonale cellen met lentivirale vectoren en maken van transgene muizen.
Abstract
Lentivirussen zijn efficiënte vectoren voor gene levering aan zoogdiercellen. Na signaaltransductie, het lentivirale genoom stabiel is geïntegreerd in het host-chromosoom en wordt doorgegeven aan het nageslacht. Ze zijn dus ideale vectoren voor schepping van stabiele cellijnen, in vivo levering van indicatoren, en transductie van eencellige bevruchte eieren maken van transgene dieren. Echter muis bevruchte eieren en vroege fase embryo’s worden beschermd door de zona zitten, een glycoproteïne-matrix die een barrière tegen lentivirale gene levering vormt. Lentivirussen zijn te groot om door te dringen de zona en worden meestal geleverd door microinjection van virale deeltjes in de holte van de perivitelline, de ruimte tussen de zona en de embryonale cellen. De behoefte aan hoogopgeleide technologen en gespecialiseerde apparatuur heeft het gebruik van lentivirussen voor gene levering aan muis embryo’s tot een minimum beperkt. Dit artikel beschrijft een protocol voor het permeabilizing van de muis bevruchte eieren door de zona perforeren met een laser. Laser-perforatie resulteert niet in enige schade aan embryo’s en maakt van lentivirussen toegang te krijgen tot embryonale cellen voor gene levering. Getransduceerde embryo’s kunnen uitgroeien tot een blastocyst in vitro en als geïmplanteerd in pseudopregnant muizen, uitgroeien tot transgene pups. De laser gebruikt in dit protocol is effectief en makkelijk te gebruiken. Genen geleverd door lentivirussen stabiel integreren van muis embryonale cellen en zijn germline overdraagbare. Dit is een alternatieve methode voor het maken van transgene muizen die geen micromanipulation vereist en microinjection van bevruchte eieren.
Introduction
Deze methode biedt gedetailleerde instructies voor het permeabilizing van de zona zitten van muis bevruchte eieren embryonale cellen om toegankelijk te maken voor levering van het gen van lentivirussen. Lentivirussen zijn ontworpen door de natuur voor efficiënte gene levering aan zoogdiercellen. Ze verdelen en niet-delende cellen infecteren en het lentivirale genoom te integreren in hun host chromosomen1. Het cellenbereik lentivirale host is gemakkelijk uitgebreid door pseudotyping de recombinante lentivirus met de vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSV-G), vanwege de brede tropisme van de VSV-G eiwit2. Na signaaltransductie, lentivirale genen zijn stabiel geïntegreerd en uitgedrukt als onderdeel van hun gastheer chromosomen maken een ideaal hulpmiddel voor het genereren van transgene dieren. Geleverd aan de vroege fase embryonale stamcellen, is het lentivirale genoom gerepliceerd als uitgedrukt in het hele organisme. Lentivirale transductie heeft geleid tot de productie van kwartel, muizen, ratten, kip en varken3,4,5,6,7 onder andere soorten van transgenics. De typische methode van levering van de lentivirale gen, vereist echter geschoolde technici en gespecialiseerde apparatuur te overwinnen van de zona zitten barrière die de vroege fase embryo’s kapselt. Het algemene doel van deze methode is om te beschrijven hoe permeabilize de zona met behulp van een laser om lentivirale gene steunverlening te vergemakkelijken.
Zoogdieren eieren zijn omringd door de zona zitten die verhardt na bevruchting de bevruchte eieren tegen polyspermy te beschermen en beperken van de milieu-interacties8,9. De zona vormt een barrière die houdt van lentivirussen weg van de embryonale cellen, totdat de embryo’s zijn uitgekomen als een blastocyst. Gekweekte muis bevruchte eieren hatch na 4 dagen en pseudopregnant muizen vóór broedeieren voor normale ontwikkeling in pups moet worden ingeplant. Daarom, voor signaaltransductie, lentivirussen zijn microinjected voor broedeieren van de zona in de holte van de perivitelline, de ruimte tussen de zona en de embryonale cellen.
De zona zitten vaak voor in vitro bevruchting van menselijke eicellen te verhogen van de bevruchting tarief10verwijderd. Echter, chemische verwijdering van muis zona zitten nadelig beïnvloedt muis embryo-ontwikkeling en is schadelijk voor de embryonale cellen11,12. Andere methoden voor gene levering aan muis bevruchte eieren overwonnen de barrière van de zona zitten door directe microinjection van DNA in de cel nucleus13. Pronuclear microinjection is een efficiënt middel van het leveren van genen aan embryo’s. Aangezien elk embryo wordt gehouden in de plaats individueel voor microinjection, kan de praktijk echter moeizaam en tijdrovend voor een beginnende gebruiker.
Andere methoden zoals electroporation en photoporation zijn nuttig voor van voorbijgaande aard en op korte termijn gene levering aan muis bevruchte eieren14,15,16. Deze methoden worden uitvoerig gebruikt voor het leveren van CRISPR-Cas9 componenten en recombinases. Nochtans, niet electroporation en photoporation levering van genen efficiënt worden gebruikt voor het maken van transgenics. Spermacellen die worden bijeengezocht uit geperforeerde muis bijbal kunnen ook worden getransduceerde door lentivirussen en gebruikt voor in vitro bevruchting voor de productie van transgene dieren17,18,19, 20.
In dit protocol, wordt de levering van de lentivirale gen aan muis embryo’s vergemakkelijkt door de zona met behulp van een laser permeabilizing. De laser XYClone werd ontwikkeld als hulpmiddel voor in vitro bevruchting21 en teelt van embryonale stamcellen22. Het is een klein apparaat dat is eenvoudig te installeren en eenvoudig te gebruiken. Eenmaal geïnstalleerd op een Microscoop, maar de ruimte van een objectief neemt en de bijgeleverde software zorgt voor de laser gericht terwijl u door de Microscoop oculairs (Zie Protocol: hoofdstuk 3). Wanneer de zona wordt geperforeerd door de XYClone laser, kunnen lentivirussen worden toegevoegd aan de voedingsbodems voor gene levering23. Meerdere lentivirussen kunnen worden gebruikt om gelijktijdig meerdere genen voor chromosomale inbouw leveren.
Dit protocol beschrijft hoe te isoleren en cultuur muis eieren bevrucht, illustreert het gebruik van laser voor perforatie van de zona zitten en demonstreert de transductie van muis embryonale cellen door lentivirussen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het vermogen van de lentivirussen te integreren in hun genoom host maakt hen een ideale vector voor stabiele gene levering. Lentivirale vectoren kunnen maximaal 8,5 kilobase paar (kbp) van genetisch materiaal die geschikt is voor cel-specifieke of afleidbare initiatiefnemers, selectie markeringen of fluorescerende wordt. Opgenomen genomische materiaal kan repliceren als onderdeel van hun gastheer genoom en express te deactiveren op gewenste tijdstippen worden geregeld. Deze vectoren kunnen Spatio controle over genexpress…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van het National Institute of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Wij zijn dankbaar aan Dr Robert Petrovich en Dr. Jason Williams voor de kritische lezing van het manuscript en nuttig advies. Wij wil ook erkennen en Dr. Bernd Gloss, de Knockout kern, de Stroom Cytometry faciliteit, de fluorescentie microscopie en Imaging Center, en de faciliteiten van de vergelijkende tak van de geneeskunde van de NIEHS voor hun technische bijdrage bedanken. We zouden graag bedank Mr. David Goulding van de vergelijkende tak van de geneeskunde en Ms. Lois Wyrick van het Imaging Center op de NIEHS voor ons te voorzien van foto’s en illustraties.
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , (2007).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).
- McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
- Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).
- Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).
- Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
- Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).
- Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).
- Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).
- Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).
- Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).
- Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
- Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).
- Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
- Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).
- Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006 (2), (2006).
- Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
