Oeufs fécondés de livraison assistée par laser des gènes gène aux souris
Summary
Souris fécondés et les embryons au stade précoce sont protégés par la zone pellucide, une matrice de glycoprotéine qui forme une barrière contre la livraison de gène. Cet article décrit un protocole pour perforer le zona avec un laser à transduce des cellules embryonnaires avec vecteurs LENTIVIRAUX et à créer des souris transgéniques.
Abstract
Lentivirus sont des vecteurs efficaces pour gène de cellules de mammifères. Suite de transduction, le génome des gènes est solidement intégré dans le chromosome de l’hôte et est transmis à la descendance. Ils sont donc un vecteur idéal pour la création de lignées cellulaires stables, en vivo livraison d’indicateurs et la transduction des oeufs seule cellule fertilisée pour créer des animaux transgéniques. Cependant, souris des oeufs fécondés et les embryons au stade précoce sont protégés par la zone pellucide, une matrice de glycoprotéine qui forme une barrière contre la livraison de gène des gènes. Lentivirus sont trop grosses pour pénétrer la zona et sont généralement livrés par microinjection de particules virales dans la cavité périvitellin, l’espace entre le zona et les cellules embryonnaires. L’exigence de techniciens hautement qualifiés et d’équipements spécialisés a réduit au minimum l’utilisation de lentivirus pour la livraison de gène à des embryons de souris. Cet article décrit un protocole pour perméabiliser les oeufs souris fécondée par perforer le zona avec un laser. Laser-perforation n’entraîne pas de dommages aux embryons et permet des lentivirus accéder aux cellules embryonnaires pour la livraison de gène. Transduite embryons peuvent devenir blastocyste in vitro et si implantés chez des souris pseudopregnant, évoluer vers des chiots transgéniques. Le laser utilisé dans le présent protocole est efficace et facile à utiliser. Gènes envoyés par lentivirus stablement incorporent sur les cellules embryonnaires de souris et sont transmissible germline. Il s’agit d’une méthode alternative pour la création de souris transgéniques qui ne nécessite aucun micromanipulation et microinjection des oeufs fécondés.
Introduction
Cette méthode fournit des instructions détaillées pour perméabiliser la zone pellucide des oeufs fécondée de souris pour fabriquer des cellules embryonnaires accessibles pour la livraison de gène de lentivirus. Lentivirus ont été conçues par nature pour la livraison efficace de gène aux cellules de mammifères. Ils infectent les cellules en division et non de division et intègrent le génome des gènes de leur hôte chromosomes1. La plage de cellules de l’hôte des gènes est facilement développée par pseudotypage le lentivirus recombinant avec la glycoprotéine de virus de stomatite vésiculaire (VSV-G), en raison de la large tropisme de la VSV-G protein2. Suite de transduction, les gènes des gènes sont stablement intégrés et exprimées dans le cadre de leurs chromosomes hôtes créant un outil idéal pour la production d’animaux transgéniques. S’il est livré à des cellules embryonnaires au stade précoce, le génome des gènes est reproduit et exprimé dans tout l’organisme. Transduction LENTIVIRAUX a conduit à la production de rat, souris, cailles, poulet et porc3,4,5,6,7 , parmi d’autres espèces d’organismes transgéniques. La méthode typique de la livraison de gène des gènes, toutefois, exige des techniciens qualifiés et un équipement spécialisé pour surmonter la barrière de la zone pellucide qui encapsule les embryons au stade précoce. L’objectif général de cette méthode est de décrire comment permeabilize la zona en utilisant un laser pour faciliter la livraison de gène des gènes.
Des oeufs chez les mammifères sont entourées par la zone pellucide qui durcit après la fertilisation afin de protéger les œufs fécondés contre polyspermie et de limiter les interactions environnementales8,9. Le zona forme une barrière qui empêche les lentivirus loin les cellules embryonnaires jusqu’à ce que les embryons sont éclos comme un blastocyste. Cultivés de souris fécondé les œufs éclosent après 4 jours et doivent être implantés chez des souris pseudopregnant avant l’éclosion pour un développement normal dans les petits. Par conséquent, pour la transduction, lentivirus sont micro avant l’éclosion de la zona dans la cavité périvitellin, l’espace entre le zona et les cellules embryonnaires.
La zone pellucide est souvent supprimée pour fécondation in vitro des ovocytes humains pour augmenter le taux de fécondation10. Cependant, élimination chimique de souris zone pellucide négativement affecte le développement embryonnaire chez la souris et est nocive pour les cellules embryonnaires11,12. Autres méthodes pour la livraison de gène aux oeufs souris fécondée surmonter la barrière de la zone pellucide par microinjection directe de l’ADN dans le noyau de cellule13. Microinjection pronucléaire est un moyen efficace de transporter les gènes dans des embryons. Toutefois, étant donné que chaque embryon est maintenu en place individuellement pour la micro-injection, la pratique peut être laborieux et fastidieux pour un utilisateur novice.
Autres méthodes comme l’électroporation et photoporation sont utiles pour transitoire et à court terme livraison de gène aux souris fécondés oeufs14,15,16. Ces méthodes sont largement utilisés pour livrer les recombinases et composants CRISPR-Cas9. Cependant, électroporation et photoporation livraison de gènes ne peut servir efficacement à créer des organismes transgéniques. Les spermatozoïdes qui proviennent de l’épididyme souris crevé aussi peuvent être transduites par lentivirus et utilisés pour la fécondation in vitro pour produire des animaux transgéniques17,18,19, 20.
Dans ce protocole, la livraison de gène des gènes à des embryons de souris est facilitée par perméabiliser le zona à l’aide d’un laser. Le laser XYClone a été développé pour aider à l’in vitro fertilization21 et de la culture de cellules souches embryonnaires,22. C’est un petit appareil qui est simple à installer et facile à utiliser. Une fois installé sur un microscope, il occupe la place d’une lentille de l’objectif et le logiciel permet pour viser le laser tout en regardant dans les oculaires de microscope (voir protocole: l’article 3). Une fois que le zona est perforé par le laser XYClone, lentivirus peuvent être introduits dans les milieux de culture pour la livraison de gène23. Lentivirus multiples pourraient servir à offrir simultanément plusieurs gènes chromosomiques incorporation.
Ce protocole décrit comment isoler et souris de la culture des oeufs fécondés, illustre l’utilisation de laser pour la perforation de la zone pellucide et illustre la transduction des cellules embryonnaires de souris de lentivirus.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacité des lentivirus à intégrer dans leur génome de l’hôte rend un vecteur idéal pour la livraison de gène stable. Vecteurs LENTIVIRAUX peuvent transporter jusqu’à 8,5 kilobases paire (kbp) du matériel génétique pouvant accueillir les promoteurs spécifiques des cellules ou inductibles, marqueurs de sélection ou moitiés fluorescents. Constituée de matériel génomique peut répliquer dans le cadre de leur génome de l’hôte et réglementé pour exprimer ou désactiver aux moments souhaités. Ces v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le programme de recherche intra-muros du National Institute of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Nous sommes reconnaissants à m. Robert Petrovich et le Dr Jason Williams pour une lecture critique du manuscrit et conseils utiles. Nous tenons aussi à remercier Dr. Bernd Gloss, le noyau Knockout, le Flow Cytometry Facility, la microscopie de Fluorescence et centre d’imagerie et les installations de la direction générale de la médecine Comparative du NIEHS pour leurs contributions techniques. Nous tenons à remercier M. David Goulding de la branche de médecine Comparative et Mme Lois Wyrick le centre d’imagerie du NIEHS pour nous avoir fourni les photos et illustrations.
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
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