بيض المخصب إيصال الجينات لينتيفيرال ساعد الليزر للماوس
Summary
ماوس البويضات المخصبة والأجنة مرحلة مبكرة محمية بواسطة zona pellucida، مصفوفة بروتين سكري يشكل عائقا يحول دون إيصال الجينات. توضح هذه المقالة بروتوكول لتثقيب زونا بليزر ترانسدوسي الخلايا الجنينية مع ناقلات لينتيفيرال وخلق الفئران المعدلة وراثيا.
Abstract
لينتيفيروسيس ناقلات فعالة لإيصال الجينات إلى خلايا الثدييات. وبعد توصيل، الجينوم لينتيفيرال ستابلي أدمجت في كروموسوم المضيف ويتم تمريره إلى ذرية. وبالتالي، نواقل مثالية لإنشاء خطوط الخلايا مستقرة و في فيفو تقديم مؤشرات، وتوصيل البيض خلية واحدة مخصبة لخلق الحيوانات المحورة وراثيا. ومع ذلك، الفأرة المخصبة البيض وأوائل مرحلة الأجنة محمية بواسطة بيلوسيدا زونا، مصفوفة بروتين سكري يشكل عائقا يحول دون إيصال الجينات لينتيفيرال. Lentiviruses كبيرة جداً لاختراق زونا وهي عادة ألقاه microinjection الجسيمات الفيروسية في تجويف بيريفيتيليني، والمسافة بين زونا والخلايا الجنينية. شرط التكنولوجيين ذوي المهارات العالية والمعدات المتخصصة قد التقليل من استخدام لينتيفيروسيس لتوصيل الجينات للأجنة الماوس. توضح هذه المقالة بروتوكول بيرميبيليزينج البيض الفأرة المخصبة تثقيب زونا بليزر. تثقيب الليزر لا ينتج أي ضرر على الأجنة ويسمح لينتيفيروسيس للوصول إلى الخلايا الجنينية لإيصال الجينات. يمكن أن تتطور لتصبح الكيسة في المختبر، وإذا كان مزروع في الفئران بسيودوبريجنانت، تتطور إلى الجراء المعدلة وراثيا الأجنة ترانسدوسيد. الليزر المستخدمة في هذا البروتوكول فعالة وسهلة الاستخدام. ودمج الخلايا الجنينية الماوس الجينات ألقاه lentiviruses ستابلي germline المعدية. هذا هو أسلوب بديل لإيجاد الفئران المعدلة وراثيا التي تتطلب لا ميكرومانيبوليشن و microinjection البويضات المخصبة.
Introduction
هذا الأسلوب يوفر إرشادات مفصلة عن بيرميبيليزينج بيلوسيدا زونا البيض الفأرة المخصبة جعل الخلايا الجنينية موجوداً لإيصال الجينات التي لينتيفيروسيس. لينتيفيروسيس مصممة بطبيعتها لإيصال الجينات تتسم بالكفاءة لخلايا الثدييات. أنها تصيب الفاصل وعدم تقسيم الخلايا ودمج الجينوم لينتيفيرال الكروموسومات المضيف1. سهولة توسيع نطاق الخلايا المضيفة لينتيفيرال من بسيودوتيبينج lentivirus المؤتلف مع التهاب الفم الحويصلي الفيروس بروتين سكري (منظمة-ز)، سبب انتحاء واسعة من البروتين منظمة-ز2. وبعد توصيل، ستابلي الجينات لينتيفيرال متكاملة والتعبير عنها كجزء من الكروموسومات المضيف إنشاء أداة مثالية لتوليد الحيوانات المحورة وراثيا. إذا سلمت إلى المرحلة المبكرة الخلايا الجنينية، الجينوم لينتيفيرال تكرارها والمعرب عنها في الكائن الحي كامل. وقد أدى إلى إنتاج الفئران والجرذان، والدجاج والسمان توصيل لينتيفيرال وخنزير3،،من45،،من67 من بين الأنواع الأخرى من الوراثي. ومع ذلك، يتطلب الأسلوب النموذجي لإيصال الجينات لينتيفيرال، الفنيين المهرة والمعدات المتخصصة للتغلب على الحاجز zona pellucida بتغليف الأجنة المرحلة المبكرة. والهدف العام لهذا الأسلوب لوصف كيفية بيرميبيليزي زونا استخدام ليزر لتسهيل إيصال الجينات لينتيفيرال.
بيض الثدييات محاطة بيلوسيدا زونا التي يصلب بعد الإخصاب لحماية البيض المخصب ضد بوليسبيرمي والحد من التفاعلات البيئية8،9. زونا أشكال حاجز الذي يحتفظ لينتيفيروسيس بعيداً عن الخلايا الجنينية حتى هي دبرت الأجنة الكيسة. المستزرعة الفأرة المخصبة يفقس البيض بعد 4 أيام ويجب أن يكون مزروع في الفئران بسيودوبريجنانت قبل الفقس للتطور الطبيعي في الجراء. ولذلك، لتوصيل، هي ميكروينجيكتيد لينتيفيروسيس قبل الفقس من زونا تجويف بيريفيتيليني، والمسافة بين زونا والخلايا الجنينية.
غالباً ما تتم إزالة بيلوسيدا زونا للاخصاب في الأنابيب من البويضات البشرية لزيادة معدل التسميد10. ومع ذلك، الكيميائية إزالة الماوس zona pellucida سلبا يؤثر نمو الجنين الماوس والضارة بالخلايا الجنينية11،12. طرق أخرى لإيصال الجينات إلى البيض الفأرة المخصبة التغلب على الحاجز zona pellucida microinjection المباشر للحمض النووي في نواة الخلية13. Pronuclear microinjection وسيلة فعالة لإيصال الجينات إلى الأجنة. ومع ذلك، منذ يقام كل الأجنة في مكان على حدة ل microinjection، يمكن الممارسة شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً لمستخدم مبتدئ.
أساليب أخرى مثل انهانسر وفوتوبوريشن مفيدة عابرة وإيصال الجينات القصيرة الأجل للماوس يخصب البيض14،،من1516. هذه الأساليب تستخدم على نطاق واسع لتوصيل المكونات كريسبر-Cas9 وريكومبيناسيس. ومع ذلك، لا يمكن استخدام التسليم انهانسر وفوتوبوريشن من الجينات كفاءة لخلق الوراثي. المني التي يتم جمعها من البربخ الماوس ثقب يمكن أيضا ترانسدوسيد من لينتيفيروسيس وتستخدم للاخصاب في المختبر لإنتاج الحيوانات المحورة وراثيا17،،من1819، 20.
في هذا البروتوكول، وتيسر إيصال الجينات لينتيفيرال للأجنة الماوس بيرميبيليزينج زونا استخدام ليزر. وقد وضعت الليزر زيكلون كمساعدة للاخصاب في الأنابيب 21 وزراعة الخلايا الجذعية الجنينية22. وهو جهاز صغير بسيط للإعداد وسهلة الاستخدام. مرة واحدة مثبتة على مجهر، تحتل المساحة من عدسة الهدف ويسمح البرنامج المصاحب لهدف الليزر بينما كانوا يبحثون عن طريق العدسات المجهر (انظر البروتوكول: الفرع 3). مرة واحدة هو مثقب زونا واسطة الليزر زيكلون، يمكن إدخال لينتيفيروسيس في ثقافة وسائل الإعلام ل إيصال الجينات23. يمكن استخدام لينتيفيروسيس متعددة في نفس الوقت تقديم عدة جينات لإدماج الكروموسومات.
هذا البروتوكول سوف تصف كيفية عزل والماوس الثقافة يخصب البيض، ويوضح استخدام الليزر لانثقاب بيلوسيدا زونا ويوضح توصيل الماوس الخلايا الجنينية بواسطة لينتيفيروسيس.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدرة لينتيفيروسيس على الاندماج على جينوم مضيف يجعلها متجه مثالية لإيصال الجينات مستقرة. يمكن أن تحمل ناقلات لينتيفيرال يصل إلى 8.5 كيلوبس زوج (kbp) المواد الجينية التي يمكن أن تستوعب المروجين خلية محددة أو إيندوسيبلي أو علامات التحديد مويتيس الفلورسنت. يمكن إجراء نسخ متماثل كجزء من جينوم مض?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث “برنامج البحوث الداخلية” للمعهد الوطني للصحة (NIH)، “الوطني معهد لعلوم الصحة البيئية” (نيس). ونحن ممتنون للدكتور روبرت بيتروفيتش والدكتور جيسون وليامز لقراءة نقدية للمخطوطات ونصائح مفيدة. كما نود أن نعترف وأشكر الدكتور بيرند اللمعان ولب خروج المغلوب ومرفق التدفق الخلوي، مجهرية Fluorescence ومركز التصوير وتسهيلات “نسبية الطب فرع” نيس لمساهماتهم الفنية. ونود أن نشكر السيد ديفيد غولدنغ من “فرع الطب المقارن” والسيدة لويس ويريك من مركز التصوير في نيس على تزويدنا بالصور والرسوم التوضيحية.
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , (2007).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).
- McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
- Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).
- Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).
- Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
- Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).
- Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).
- Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).
- Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).
- Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).
- Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
- Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).
- Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
- Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).
- Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006 (2), (2006).
- Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
