침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템
Summary
방광 암 침공을 관리 하는 프로세스는 바이오 마커 및 치료 개발을 위한 기회를 나타냅니다. 여기 우리는 종양 spheroids 시간 경과 화상 진 찰, confocal 현미경 검사 법의 3 차원 문화를 통합 하는 방광 암 침공 모델 제시. 이 기술은 침략 과정의 기능을 정의 하 고 치료제 심사에 대 한 유용 합니다.
Abstract
방광 암은 중요 한 건강 문제 이다. 그것은 추정 이상 16000 사람들 방광 암에서 미국에서 올해를 죽을 것 이다. 방광 암의 75%는 비 침 습과 전이 가능성, 약 25%는 침략 적인 성장 패턴을 진행 합니다. 침 윤 성 암 환자의 절반 최대 치명적인 전이성 재발을 개발할 것입니다. 따라서, 환자 결과 예측 하 고 치명적인 전이 방지 하는 중요 한 이다 방광 암에 침략 적 진행의 메커니즘을 이해. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포 및 기질 구성 요소 vivo에서 발생 하는 조건에서 방광 종양 microenvironment 모방의 설립을 허용 하는 3 차원 암 침공 모델 제시. 이 모델에는 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여 실시간으로에서 침입 과정을 관찰, 블록 침공 가능성 confocal immunofluorescent 이미징 및 화면 화합물을 사용 하 여 관련 된 분자 경로 심문 하 기회를 제공 한다. 이 프로토콜은 방광 암에 초점을 맞추고, 그것은 유사한 방법 침공과 운동 성 뿐만 아니라 다른 종양 유형에서 검사 사용 될 수 가능성이 높습니다.
Introduction
침략은 암 진행, 전이, 필요한 이며 낮은 생존 및 환자에 있는 빈약한 예 지와 관련 있는 중요 한 단계 이다. 인간의 방광 암, 요로 전세계 연간 약 165000 사망 원인의 가장 일반적인 악성 암 단계, 치료 및 예 후는 직접 관련이 침공1의 유무. 방광 암의 경우 약 75%는 비 근육 침략과 관리 지역 절제와 함께. 반면, 근육 침 윤 성 방광 암 (모든 경우의 약 25%) 높은 전이성 속도 공격적인 종양 이며 적극적인 multimodality 치료2,3와 함께 처리 됩니다. 따라서, 이해 하는 분자 경로 침략을 방 아 쇠를 침략 적 진행을 방지할 수 있는 치료 내정간섭을 개발 하 고 더 침략 적 진행의 위험 특성을 필수적 이다.
종양 침 습 진행 복잡 한 3 차원 (3 차원) 환경에서 발생 하 고 다른 종양 세포, 기질, 지하실 멤브레인와 다른 종류의 세포 면역 세포, 섬유 아 세포, 근육 세포를 포함 하 여 종양 세포 상호 작용을 포함 하 고 혈관 내 피 세포입니다. 그들은 실시간으로 침공 과정의 미세한 모니터링을 허용 하지 않습니다 때문에 침투성 지원 (예, Transwell) 분석 결과 시스템은 일반적으로 암 세포 침공4, 하지만이 시스템을 quantitate를 고용 제한 됩니다 및 검색 더 얼룩 및 분자 분석에 대 한 샘플의 도전 이다. 체 외에 시스템의 편의 함께 정의 된 microenvironmental 구성 요소의 설립을 허용 하기 때문에 침공을 공부 하는 3 차원 방광 종양 회전 타원 체 시스템 개발이 바람직합니다.
이 프로토콜에서 세포 운동 성 모니터링 조사 관 수 있도록 콜라겐 기반 젤 매트릭스와 confocal 현미경 검사 법 통합 3 차원 회전 타원 체 침공 분석 결과 사용 하 여 인간의 방광 암 세포의 침입 과정을 심문 하는 시스템을 설명 하 고 실시간으로 (그림 1A)에 침공. 이 시스템은 다양 한 고가 다양 한 stromal 종양 설정을 수정할 수 있습니다. 그것은 암 관련 된 섬유 아 세포 및 면역 세포5,,67와 같은 대부분의 방광 암 세포 선 또는 기본 방광 종양와 추가 stromal 세포 통합할 수 있습니다. 이 프로토콜 타입-1 콜라겐으로 구성 된 행렬을 설명 하지만 fibronectin, laminin, 또는 다른 콜라겐 단백질 등 다른 분자를 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 현미경을 사용 하는 시스템의 기능에 따라 72 h 이상 침입 프로세스를 다음 수 있습니다. 고정 및 이전, 도중, 그리고 침략 후 3 차원 매트릭스에 포함 된 종양의 면역 형광 얼룩 수 단백질 upregulated 침입 세포에 따라서 일반적으로 결 석 또는 수집 하기 어려운 중요 한 정보를 제공의 심문 다른 3 차원 문화 모델을 사용 하 여. 이 시스템 신호 경로 같은 화합물에 의해 영향을 나타냅니다 하 고 침입을 차단 하는 스크린 화합물에도 활용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기는 방광 암은 암 진행과 전이 대 한 중요 한 침입의 실시간 관찰을 허용 하는 3 차원 종양 회전 타원 체 모델에 설명 합니다. 이 시스템은 다양 한 기질과 세포 구성 요소 있도록 더 나은 정리를 조사 조직 microenvironment 방광 암 침공 수행의 의무가 있습니다. 방광 암 spheroids (를 포함 하 여 유전자 변형된 세포 선을 침공 프로세스에 영향을 주는 경로 신호의 검사에 유용), 셀 라인 등 다양 한 소스…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기술 지원 및 제공 자료와이 연구에 대 한 장비 및 기술 지원에 대 한 앨런 Kelleher 박사 하 워드 크로포드 (미시간 대학)의 실험실을 감사 하 고 싶습니다.
이 작품은 미시간 Rogel 암 센터 코어 그랜트 CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS)의 대학에서 교부 금에 의해 투자 되었다.
Materials
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
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