침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템

요약

방광 암 침공을 관리 하는 프로세스는 바이오 마커 및 치료 개발을 위한 기회를 나타냅니다. 여기 우리는 종양 spheroids 시간 경과 화상 진 찰, confocal 현미경 검사 법의 3 차원 문화를 통합 하는 방광 암 침공 모델 제시. 이 기술은 침략 과정의 기능을 정의 하 고 치료제 심사에 대 한 유용 합니다.

초록

방광 암은 중요 한 건강 문제 이다. 그것은 추정 이상 16000 사람들 방광 암에서 미국에서 올해를 죽을 것 이다. 방광 암의 75%는 비 침 습과 전이 가능성, 약 25%는 침략 적인 성장 패턴을 진행 합니다. 침 윤 성 암 환자의 절반 최대 치명적인 전이성 재발을 개발할 것입니다. 따라서, 환자 결과 예측 하 고 치명적인 전이 방지 하는 중요 한 이다 방광 암에 침략 적 진행의 메커니즘을 이해. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포 및 기질 구성 요소 vivo에서 발생 하는 조건에서 방광 종양 microenvironment 모방의 설립을 허용 하는 3 차원 암 침공 모델 제시. 이 모델에는 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여 실시간으로에서 침입 과정을 관찰, 블록 침공 가능성 confocal immunofluorescent 이미징 및 화면 화합물을 사용 하 여 관련 된 분자 경로 심문 하 기회를 제공 한다. 이 프로토콜은 방광 암에 초점을 맞추고, 그것은 유사한 방법 침공과 운동 성 뿐만 아니라 다른 종양 유형에서 검사 사용 될 수 가능성이 높습니다.

서론

침략은 암 진행, 전이, 필요한 이며 낮은 생존 및 환자에 있는 빈약한 예 지와 관련 있는 중요 한 단계 이다. 인간의 방광 암, 요로 전세계 연간 약 165000 사망 원인의 가장 일반적인 악성 암 단계, 치료 및 예 후는 직접 관련이 침공¹의 유무. 방광 암의 경우 약 75%는 비 근육 침략과 관리 지역 절제와 함께. 반면, 근육 침 윤 성 방광 암 (모든 경우의 약 25%) 높은 전이성 속도 공격적인 종양 이며 적극적인 multimodality 치료^2,3와 함께 처리 됩니다. 따라서, 이해 하는 분자 경로 침략을 방 아 쇠를 침략 적 진행을 방지할 수 있는 치료 내정간섭을 개발 하 고 더 침략 적 진행의 위험 특성을 필수적 이다.

종양 침 습 진행 복잡 한 3 차원 (3 차원) 환경에서 발생 하 고 다른 종양 세포, 기질, 지하실 멤브레인와 다른 종류의 세포 면역 세포, 섬유 아 세포, 근육 세포를 포함 하 여 종양 세포 상호 작용을 포함 하 고 혈관 내 피 세포입니다. 그들은 실시간으로 침공 과정의 미세한 모니터링을 허용 하지 않습니다 때문에 침투성 지원 (예, Transw....

프로토콜

1. 성장 암 Spheroids

1. 셀 라인에서 성장
   1. 기존의 점착 아래 문화 인간 방광 암 세포 세포 문화 조건 하 고 5% CO₂와 함께 제공 되는 37 ° C 배양 기에서 유지 합니다. 에 셀 유지 < 90 %confluency.
      참고: 사용 하는 문화 미디어는 Dulbecco의 최소 필수 미디어 (DMEM) 4.5 g/L D-포도 당, L-글루타민, 110 mg/L 나트륨 pyruvate, 포함 된 수정 하 고 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)이이 프로토콜을 통해 제공.
   2. 실험의 시작에 앞서 1 일 trypsinize (0.25%를 사용 하 여 트립 신-EDTA) 셀 셀 농도 측정 및 1 x 10⁶ 셀 6-잘 매우 낮은 부착 판의 각 잘 3 mL 문화 미디어에 배포.
   3. ≥16 h에 대 한 37 ° C에서 낮은 첨부 조건 셀을 품 어. 이 셀에 대 한 충분 한 시간을 허용 해야 대부분 방광 암 세포 라인에 대 한 spheroids로 집계 하.
      참고: spheroids의 형성은 거꾸로 밝은 분야 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 최적의 크기와 spheroids의 수, 개별 실험에 따라 달라질 수 있습니다 하지만 우리는 50 µ m에서 15....

결과

침 윤 성 방광 암 종양 회전 타원 체의 성공적인 창조 적절 한 크기의 종양 세포 선 또는 1 차 종양에서 spheroids의 형성을 필요합니다. 그림 2 A 4 인간의 방광 암 세포 선 (UM UC9, UM UC13, UM UC14, 253J, 및 UM UC18)에서 개발 하는 적절 한 크기의 spheroids를 보여 줍니다. 그림 2 B 콜라겐 매트릭스에 포함 된 BBN 생성 마우스 방광 종양에서 종양 회전 타원 체를 보여줍니다. 위에서 설명한 대로 이러한 spheroids 포함 했다 고 대표 이미지 라이브 셀 이미징에 대 한 장비는 현미경을 사용 하 여 체포 되었다. 마우스 방광 종양 spheroids 5 X 10 X 렌즈를 사용 하 여 시험 되었다 반면 20 X 객관적 렌즈 이미징 UM UC9, U.......

토론

여기는 방광 암은 암 진행과 전이 대 한 중요 한 침입의 실시간 관찰을 허용 하는 3 차원 종양 회전 타원 체 모델에 설명 합니다. 이 시스템은 다양 한 기질과 세포 구성 요소 있도록 더 나은 정리를 조사 조직 microenvironment 방광 암 침공 수행의 의무가 있습니다. 방광 암 spheroids (를 포함 하 여 유전자 변형된 세포 선을 침공 프로세스에 영향을 주는 경로 신호의 검사에 유용), 셀 라인 등 다양 한 소스에서 생성 될 수 있습니다 및 기본 마우스 종양 (여기에 설명 된). 그것은 잠재적으로 수 또한 인간의 기본 종양 분석에 대 한 적응. 이미징 시스템 사용에 따라 실시간으로 또는 고정 및 다양 한 시간 포인트에서 얼룩 면역 형광 형광을 모니터링할 수 있습니다. 시스템 내 습의 잠재적인 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다. 이것은 시스템 방광 암 생물학을 평가 하기 위해 다양 하 고 강력한 도구.

기후 챔버 온도 제어, 습도 제어, 및 CO₂

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인간 방광암 세포주 UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J
DMEM 세포 배양 배지	Thermo Fisher Scientific	11995065
태아 소 혈청	Thermo Fisher Scientific	26140079
항생제-항진균제 (100x)	Thermo Fisher Scientific	15240062
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드	Thermo Fisher Scientific	25200056
소 혈청 알부민 (BSA)	Sigma-Aldrich	A3803
인산염 완충 식염수 (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023
Costar Ultral-low 첨부 6-웰 클러스터	Corning	3471
기존 도립 현미경	Carl Zeiss	491206-0001-000	세포 배양 및 스페로이드 검사를 위한 일반 사용
콜라겐 타입 1, 쥐 꼬리에서 추출, 고농도	Corning	354249
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컨포칼 현미경	Carl Zeiss	LSM800	기후 챔버, 다중 위치 이미징 및 Z-스택 스캐닝 기능을 갖춘 컨포칼 미스코스코프
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Anti-Vimentin 항체	Abcam	ab24525
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