3-b hücre kültür sistemi istila eğitim ve Mesane kanserinde tedavi değerlendirmek için
Summary
Mesane kanseri istila yönetim süreçleri biyomarker ve terapötik geliştirme fırsatları temsil eder. Burada hangi 3-b kültür tümör pulcuklarının, hızlandırılmış görüntüleme ve confocal mikroskobu birleştirmek bir mesane kanseri istila modeli mevcut. Bu teknik invaziv işlem özelliklerini tanımlamak için ve terapötik ajanlar süzmek için yararlıdır.
Abstract
Mesane kanseri önemli sağlık sorunudur. Bu 16.000’den fazla insan mesane kanseri gelen Amerika Birleşik Devletleri’nde bu yıl ölecek tahmin edilmektedir. Mesane kanserleri % 75’i non-invaziv ve metastaz olası olsa da, yaklaşık % 25 için bir invazif büyüme desen ilerleme. İnvaziv kanser hastalarının yarısı kadar öldürücü metastatik nüks gelişecektir. Böylece, invaziv mesane kanseri ilerlemesinde mekanizmasını anlamak hasta sonuçları tahmin ve öldürücü Metastazlari önlemek çok önemlidir. Bu makalede, biz tümör hücreleri ve mesane tümörü microenvironment meydana gelen vivo içinde koşulları taklit stromal bileşenleri sağlayan bir üç boyutlu kanseri istila modeli mevcut. Bu model içinde gerçek zaman zaman hata Imaging’i kullanma invaziv işlem gözlemlemek, moleküler yollar blok işgali potansiyeline sahip confocal immünfloresan görüntüleme ve ekran bileşikleri kullanarak ilgili sorguya fırsatı sağlar. Bu iletişim kuralı mesane kanseri üzerinde duruluyor olsa da, benzer yöntemleri işgali ve motilite diğer tümör tipleri de incelemek için kullanılan olabilir muhtemeldir.
Introduction
İstila metastaz için gereklidir ve alt hayatta kalma ve hastalarda kötü prognoz ile ilişkili kanser ilerleme kritik bir adımdır. İnsan mesane kanseri, her yıl dünya çapında yaklaşık 165,000 ölümler neden olur idrar yolu en yaygın malignite kanser sahne, tedavi ve prognoz doğrudan Invasion1içinse ilişkilendirilir. Mesane kanseri vakalarının yaklaşık % 75’i olan ve olmayan-kas invaziv yerel rezeksiyon ile yönetilir. Buna ek olarak, kas invaziv mesane kanserleri (yaklaşık %25 tüm servis talepleri) yüksek metastatik oranları ile agresif tümör ve agresif mobil terapi2,3ile tedavi edilir. Bu nedenle, istila tetiklemek moleküler yolları anlamak daha iyi karakterize invaziv ilerleme riski ve invaziv ilerleme önleyebilirsiniz tedavi müdahaleler geliştirmek için önemlidir.
Tümör invaziv ilerleme bir karmaşık üç boyutlu (3-D) ortamında oluşur ve diğer tümör hücreleri, stroma, membran ve hücreleri bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, kas hücreleri de dahil olmak üzere diğer türleri ile tümör hücre etkileşimi içerir ve vasküler endotel hücreleri. Onlar gerçek zamanlı işgali sürecinde mikroskobik izleme izin vermemesi nedeniyle geçirgen destek (Örneğin, Transwell) tahlil sistemleri yaygın kanser hücre işgali4ama bu sistemleri quantitate için istihdam sınırlıdır ve daha fazla boyama ve moleküler analiz için numune alınmasını meydan okuyor. Tanımlanmış microenvironmental bileşenleri birleşme vitro sistemleri kolaylık sağlar çünkü işgal eğitim için 3-b mesane tümörü küresel sisteminin geliştirilmesi arzu edilir.
Bu protokol için biz müfettişler hücre hareketliliği izlemek izin vermek için kollajen tabanlı jel matrisler ve confocal mikroskobu birleştirilerek bir 3-b küresel işgal tahlil kullanarak insan mesane kanser hücrelerinin invaziv işlemler sorguya çekmek için bir sistem tarif ve gerçek zamanlı (Şekil 1A)’ı işgal. Bu sistem çok yönlü ve çeşitli stromal/tümör ayarları sorgulamak için değiştirilebilir. Fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri5,6,7kanser ilişkili gibi çoğu mesane kanseri hücre hatları veya birincil mesane tümörleri ve ek stromal hücreler ekleyebilirsiniz. Bu iletişim kuralı tip-1 kollajen oluşan bir matris açıklar, ancak diğer molekülleri fibronektin laminin veya diğer kollajen protein gibi dahil etmek için değiştirilebilir. İnvaziv işlemler için 72 saat veya daha uzun mikroskop ve kullanılan sistemi bağlı olarak izlenebilir. Fiksasyon ve 3-b matrix önce sırasında ve sonrasında işgal gömülü tümör ayirt boyama sağlar böylece çok önemli bilgiler genellikle yok veya toplamak zor sağlayan proteinler upregulated invaziv hücrelerdeki sorgulama diğer 3-b kültür modellerini kullanarak. Bu sistem ayrıca işgal engellemek ekran bileşikleri ve sinyal yollar böyle bileşikler tarafından etkilenen betimlemek için yararlı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada kanser ilerlemesi ve metastaz için kritik olan mesane kanseri işgalinin gerçek zamanlı gözlem izin veren bir 3-b tümör küresel modeli açıklar. Bu sistem daha iyi özetlemek için Müfettişler nerede mesane kanseri istila gerçekleşir doku microenvironment izin vermek için çeşitli stromal ve hücresel bileşenleri birleşme için mükellef. Mesane kanseri pulcuklarının hücre hatları (genetiği değiştirilmiş hücre hatları işgali süreçleri etkiler yolları sinyal sınav için yararlı da da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr Howard Crawford (Michigan Üniversitesi) laboratuvar teknik destek ve sağlayan malzemeler ve bu çalışma için donatım ve teknik destek için Alan Kelleher için teşekkür etmek istiyorum.
Bu eser Üniversitesi Michigan Rogel Kanser Merkezi çekirdek Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PIP), bBu YIA (PIP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS)’nden hibe tarafından finanse edildi.
Materials
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. . The Society. , (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M. Three-dimensional context regulation of metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).
