Sistema de cultura de células 3D para estudar a invasão e avaliação terapêutica em câncer de bexiga
Summary
Os processos que regem a invasão do câncer de bexiga representam oportunidades para o desenvolvimento de terapêutico e biomarcador. Aqui nós apresentamos um modelo de invasão de câncer de bexiga que incorpora a cultura 3D de esferoides de tumor, imagem latente de lapso de tempo e microscopia confocal. Essa técnica é útil para definir as características do processo invasivo e para a seleção de agentes terapêuticos.
Abstract
Câncer de bexiga é um problema significativo para a saúde. Estima-se que mais de 16.000 pessoas morrerão este ano nos Estados Unidos de câncer de bexiga. Enquanto 75% dos cânceres de bexiga são invasivos e improvável que metastatizam, cerca de 25% de progresso para um padrão de crescimento invasivo. Até metade dos pacientes com câncer invasivo desenvolverá letal recaída metastática. Assim, compreender o mecanismo de progressão invasiva no câncer de bexiga é crucial para prever os resultados dos pacientes e prevenir metástases letais. Neste artigo, apresentamos um modelo de invasão do câncer tridimensional que permite a incorporação de células tumorais e componentes do estroma para imitar na vivo condições ocorrem no microambiente do tumor de bexiga. Este modelo fornece a oportunidade de observar o processo invasivo em tempo real utilizando imagens de lapso de tempo, interrogar as vias moleculares envolvidos usando compostos de imagem e tela de imunofluorescência confocal com o potencial de invasão de bloco. Enquanto este protocolo centra-se em câncer de bexiga, é provável que métodos semelhantes poderiam ser usados para examinar a invasão e a mobilidade, bem como outros tipos de tumor.
Introduction
Invasão é um passo fundamental na progressão do câncer, que é necessário para a metástase e está associado a baixa sobrevivência e mau prognóstico em pacientes. Em câncer de bexiga humana, a mais comum malignidade do tracto urinário, o que faz com que cerca de 165.000 mortes por ano em todo o mundo, prognóstico, tratamento e estágio do câncer estão diretamente relacionadas com a presença ou ausência de invasão1. Cerca de 75% dos casos de câncer de bexiga são não-músculo invasivo e são gerenciados com ressecção local. Em contraste, os cânceres de bexiga músculo-invasivos (cerca de 25% dos casos) são tumores agressivos com altas taxas de metástases e são tratados com terapia de multimodalidade agressivo2,3. Portanto, compreender as vias moleculares que desencadeiam a invasão é essencial para melhor caracterizar o risco de progressão invasiva e desenvolver intervenções terapêuticas que podem impedir a progressão invasiva.
Progressão do tumor invasivo ocorre num ambiente complexo tridimensional (3D) e envolve a interação de células de tumor com outras células do tumor, estroma, membrana basal e outros tipos de células, incluindo células do sistema imunológico, fibroblastos, células musculares e vasculares células endoteliais. Permeável ao suporte (por exemplo, Transwell), sistemas de ensaio são comumente empregados para dosar de invasão de células de câncer4, mas esses sistemas são limitados porque não permitem monitoramento microscópico do processo de invasão em tempo real e a recuperação de amostras para análise molecular e ainda mais a coloração é um desafio. Desenvolvimento de um sistema de esferoide de tumor de bexiga em 3D para estudar a invasão é desejável porque permite a incorporação de componentes microenvironmental definidos com a conveniência de sistemas em vitro .
Neste protocolo, descrevemos um sistema para interrogar os processos invasivos de células de câncer de bexiga humana usando um ensaio de invasão de esferoide 3D incorporando as matrizes de gel à base de colagénio e microscopia confocal para permitir que os investigadores monitorar a motilidade celular e invasão em tempo real (Figura 1A). Este sistema é versátil e pode ser modificado para interrogar várias configurações/tumor estromal. Pode incorporar a maioria das linhas de células de câncer de bexiga ou bexiga primário tumores e células estromais adicionais tais como cancro associado fibroblastos e células do sistema imunológico5,6,7. Este protocolo descreve uma matriz composta de colágeno tipo 1, mas pode ser modificado para incorporar outras moléculas como fibronectina, laminina ou outras proteínas de colágeno. Processos invasivos podem ser seguidos por 72 horas ou mais dependendo da capacidade do microscópio e sistema utilizado. Fixação e mancha do tumor incorporado na matriz em 3D, antes, durante e depois da invasão da imunofluorescência permite o interrogatório de proteínas upregulated em células invasoras, assim fornecendo informações cruciais que geralmente ausente ou difícil de reunir usando outros modelos de cultura em 3D. Este sistema também pode ser utilizado para compostos de tela que bloqueiam a invasão e para delinear as vias de sinalização afectadas por tais compostos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um modelo de esferoide de tumor em 3D que permite a observação em tempo real da invasão de câncer de bexiga que é crítico para metástase e progressão do câncer. Este sistema é favorável à incorporação de vários componentes do estroma e celulares para permitir que os investigadores melhor recapitular o microambiente do tecido onde ocorre invasão do câncer de bexiga. Esferoides de câncer da bexiga pode ser gerados a partir de várias fontes, tais como linhas de célula (incluindo linhas d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer o laboratório do Dr. Howard Crawford (Universidade de Michigan) para suporte técnico e fornecer materiais e equipamentos para este estudo e Alan Kelleher para suporte técnico.
Este trabalho foi financiado por doações da Universidade de Michigan Rogel Cancer Center núcleo Grant CA046592-26S3, CA201335 de NIH K08-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
Materials
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
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