3-D celle kultur-systemet for å studere invasjonen og evaluere legemiddelselskap i blærekreft

Summary

Prosesser for blære kreft invasjonen representerer muligheter for biomarkør og terapeutiske utvikling. Her presenterer vi en blære kreft invasjonen modell som inkorporerer 3D kultur svulst spheroids, tidsinnstilt bildebehandling og AC confocal mikroskopi. Denne teknikken er nyttig for å definere funksjonene av invasiv og screening terapeutiske agenter.

Abstract

Blærekreft er en betydelig helseproblem. Det er anslått at mer enn 16.000 mennesker vil dø i år i USA fra blærekreft. Mens 75% av blære kreft er ikke-invasiv og neppe å metastase, videre ca 25% til en invasiv vekstmønster. Opp til halvparten av pasienter med invasiv kreft vil utvikle dødelige metastatisk tilbakefall. Forstå mekanismen av invasiv progresjon i blærekreft er derfor avgjørende å forutsi pasientens utfall og hindre dødelige metastaser. I denne artikkelen presenterer vi en tredimensjonal kreft invasjonen modell som lar innlemmelse av kreftceller og stromal komponenter å etterligne i vivo betingelser forekommer i blæren svulst microenvironment. Denne modellen gir mulighet til å observere invasiv prosessen i sanntid ved hjelp av tidsinnstilt bildebehandling, avhøre molekylær veier involvert med AC confocal immunofluorescent bildebehandling og skjermen forbindelser med potensial til å blokkere invasjonen. Mens denne protokollen fokuserer på blærekreft, er det sannsynlig at lignende metoder kan brukes til å undersøke invasjon og motilitet i andre svulst typer også.

Introduction

Invasjonen er et viktig skritt i kreft progresjon, som kreves for metastasering, og er forbundet med lavere overlevelse og dårlig prognose hos pasienter. I menneskelige blærekreft, vanligste malignancy av urinveiene som forårsaker ca 165,000 dødsfall per år over hele verden, er kreft stadium, behandling og prognose direkte relatert til tilstedeværelse eller fravær av invasjonen¹. Rundt 75% av tilfellene av blærekreft administrert ikke-muskel invasiv og er av lokale resection. I kontrast, muskel-invasiv blære kreft (ca 25% av alle tilfeller) er aggressiv svulster med høye metastatisk og behandlet med aggressiv Multimodalitet terapi^2,3. Derfor er forstå molekylær veier som utløser invasjonen avgjørende å bedre karakterisere risikoen for invasiv progresjon og utvikle terapeutiske tiltak som kan hindre invasiv progresjon.

Svulst invasiv progresjon skjer i komplekse tredimensjonale (3D) omgivelser og innebærer svulst celle interaksjon med andre kreftceller, stroma, kjelleren membran og andre typer cellene immunceller, fibroblaster, muskelceller og vaskulære endotelceller. Permeable støtte (f.eksTranswell) analysen systemer er ofte ansatt å quantitate kreft cellen invasjonen⁴, men disse systemene er begrenset fordi de ikke tillater mikroskopiske overvåking av invasjonen i sanntid og henting av prøver for ytterligere flekker og molekylære analyse er utfordrende. Utvikling av et 3D blæren svulst spheroid system å studere invasjonen er ønskelig fordi det tillater inkorporasjon av definerte microenvironmental komponenter av in vitro -systemer.

I denne protokollen, beskriver vi et system for å avhøre invasiv prosessene av menneskelig blære kreftceller ved hjelp av en 3D-formet invasjonen analysen omfatter kollagen-baserte gel matriser og AC confocal mikroskopi spesialopplæring for etterforskere overvåke celle motilitet og invasjonen i sanntid (figur 1A). Dette systemet er allsidig og kan endres for å avhøre ulike stromal/svulst innstillinger. Det kan ta de fleste blæren kreftcelle linjer eller primære blæren svulster og flere stromal celler som kreft tilhørende fibroblaster og immunceller^5,6,7. Denne protokollen beskriver en matrise som består av type-1 kollagen, men kan endres for å innlemme andre molekyler som fibronectin, laminin eller andre kollagen proteiner. Invasiv prosesser kan følges for 72 h eller mer avhengig av evnen av mikroskopet og brukes. Fiksering og immunofluorescence flekker av svulsten innebygd i 3D-matrise før, under og etter invasjonen lar avhør av proteiner upregulated i invasiv celler, noe som gir viktig informasjon som vanligvis fraværende eller vanskelig å samle bruke andre 3D kultur modeller. Dette systemet kan også benyttes til skjermen forbindelser som blokkere invasjonen, samt avgrense signalveier påvirket av slike forbindelser.

Protocol

1. voksende kreft Spheroids Vokser fra linjer Kultur menneskelige blære kreftceller under konvensjonelle tilhenger celle oppdrettsforholdene og opprettholde i et 37 ° C inkubator leveres med 5% CO2. Opprettholde cellene på < 90% confluency.Merk: kultur medier brukt er Dulbeccos endret minimum viktige medier (DMEM) som inneholder 4.5 g/L D-glukose, L-Glutamine, 110 mg/L natrium pyruvate, og leveres med 10% fosterets bovin serum (FBS) gjennom denne protokollen. …

Representative Results

Vellykket etablering av invasiv blære kreft svulst spheroid krever dannelsen av passende størrelse svulst spheroids linjer eller primære svulster. Figur 2 En viser riktig størrelse spheroids fra fire menneskelige blære kreft cellelinjer (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J og UM-UC18). Figur 2 B viser en svulst-formet av en BBN generert musen blæren svulst i kollagen matrise. Disse spheroids ble…

Discussion

Her beskriver vi en 3D svulst spheroid modell som gjør at sanntid observasjon av blære kreft invasjonen som er kritisk for kreft progresjon og metastasering. Dette systemet er mottakelig for inkorporering av ulike stromal og cellulær komponenter slik at etterforskerne å bedre recapitulate vev microenvironment hvor blære kreft invasjonen finner sted. Blære kreft spheroids kan genereres fra ulike kilder som linjer (inkludert genmodifiserte cellelinjer nyttig for undersøkelse av signalnettverk trasé som påvirker in…

Materials

Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J
DMEM cell culture medium	Thermo Fisher Scientific	11995065
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3803
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023
Costar Ultral-low attachment 6-well cluster	Corning	3471
Conventional inverted microscope	Carl Zeiss	491206-0001-000	General use for cell culture and checking spheroids
Collagen type 1 from rat tail, high concentration	Corning	354249
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Fisher Scientific	155382
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM800	A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function
Cryostat micromtome	Leica Biosystems	CM3050 S
Zen 2 Image processing software	Carl Zeiss
Paraformaldehyde solution	Electron Microscopy Sciences	15710
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H4000
O.C.T compound	Thermo Fisher Scientific	23730571
Hoechst 33342 solution	Thermo Fisher Scientific	62249
Anti-ATDC (Trim29) antibody	Sigma-Aldrich	HPA020053
Anti-Cytokeratin 14 antibody	Abcam	ab7800
Anti-Vimentin antibody	Abcam	ab24525
ProLong Diamond			Mounting medium