3-D cellodlingssystem för att studera Invasion och utvärdera Therapeutics i Cancer i urinblåsan
Summary
De processer som styr urinblåsan cancer invasion representerar möjligheter för biomarkör och terapeutisk utveckling. Här presenterar vi en urinblåsan cancer invasion modell som innehåller 3D-kultur av tumör spheroids, time-lapse imaging och konfokalmikroskopi. Den här tekniken är användbar för att definiera funktioner i invasiv processen och för screening terapeutiska medel.
Abstract
Urinblåsecancer är ett betydande hälsoproblem. Det beräknas att mer än 16 000 personer kommer att dö i år i USA från cancer i urinblåsan. Medan 75% av urinblåsan cancer är icke-invasiv och osannolikt att metastasera, utvecklas ca 25% till en invasiv tillväxtmönster. Upp till hälften av patienterna med invasiva cancer kommer att utveckla dödliga metastaserande återfall. Thus, förstå mekanismen av invasiva progression i cancer i urinblåsan är avgörande att förutsäga behandlingsresultat och förebygga dödliga metastaser. I denna artikel presenterar vi en tredimensionell cancer invasion modell som tillåter införlivande av tumörceller och stromal komponenter att efterlikna i vivo villkor som förekommer i den blåsan tumör mikromiljö. Denna modell ger möjlighet att iaktta den invasiva processen i realtid med time-lapse imaging, förhöra de molekylära vägarna som är involverade med confocal Immunofluorescerande imaging och skärmen föreningar med potential att blockera invasion. Medan detta protokoll fokuserar på cancer i urinblåsan, är det troligt att liknande metoder kan användas för att undersöka invasionen och motilitet i andra tumörtyper samt.
Introduction
Invasionen är ett kritiskt steg i cancer progression, som krävs för metastas, och förknippas med lägre överlevnad och dålig prognos hos patienter. I mänskliga blåscancer, den vanligaste malignitet i urinvägarna som orsakar ca 165 000 dödsfall per år i hela världen, är cancer Stadium, behandling och prognos direkt relaterade till närvaro eller frånvaro av invasion1. Omkring 75% av fallen av cancer i urinblåsan är icke-muskel invasiva och är hanteras med lokal resektion. Däremot muskel-invasiv urinblåsan cancer (ca 25% av alla fall) är aggressiva tumörer med hög metastaserande och behandlas med aggressiv multimodalitet terapi2,3. Förstå de molekylära vägar som utlöser invasion är därför viktigt att bättre karakterisera risken för invasiv progression och att utveckla terapeutiska interventioner som kan förhindra invasiv progression.
Invasiv tumör progression uppstår i en komplex tredimensionell (3-D) miljö och innebär tumör cell interaktion med andra tumörceller, stroma, basalmembranet och andra typer av celler inklusive immunceller, fibroblaster, muskelceller och vaskulär endotelceller. Genomsläppliga stöd (t.ex., Transwell) analys system är vanligen anställda att kvantifiera cancer cell invasion4, men dessa system är begränsade, eftersom de inte tillåter mikroskopiska övervakning av invasion processen i realtid och hämtning av prover för ytterligare färgning och molekylär analys är utmanande. Utveckling av en 3D-urinblåsan tumör sfäroid system att studera invasion är önskvärt eftersom det möjliggör införlivandet av definierade microenvironmental komponenter med bekvämligheten av in vitro- system.
I detta protokoll, beskriver vi ett system för att förhöra de invasiva processerna human bladder cancer celler med en 3D-sfäroid invasion analys införliva kollagenbaserade gel matriser och konfokalmikroskopi att utredarna att övervaka cell motilitet och invasion i realtid (figur 1A). Detta system är mångsidig och kan modifieras för att förhöra olika tarmcancer/inställningar. Det kan införliva de flesta urinblåsan cancer cellinjer eller primära urinblåsan tumörer och ytterligare stromaceller som cancer associerade fibroblaster och immunceller5,6,7. Detta protokoll beskriver en matris består av kollagen typ 1, men kan ändras för att införliva andra molekyler som Fibronektin, laminin och kollagen proteiner. Invasiva processer kan följas för 72 h eller längre beroende på förmågan av Mikroskop och system som används. Fixering och immunofluorescens färgning av tumören inbäddad i den 3D-matrisen före, under och efter invasionen tillåter förhör av proteiner uppreglerad i invasiv celler, vilket ger viktig information som vanligtvis frånvarande eller svårt att samla använda andra 3D-kultur-modeller. Detta system kan också utnyttjas på skärmen föreningar som blockera invasion, och att avgränsa signalvägar som påverkas av sådana föreningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en 3D-tumör sfäroid modell som tillåter realtid observation av urinblåsan cancer invasion som är kritiska för cancer progression och metastasering. Detta system är mottagliga för införlivandet av olika stromaceller och cellulära komponenter så att utredarna att bättre sammanfatta den vävnad mikromiljö där urinblåsan cancer invasion sker. Urinblåsan cancer spheroids kan genereras från olika källor såsom cellinjer (inklusive genetiskt modifierade cellinjer som är användbar för under…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Howard Crawford (University of Michigan) laboratoriet för teknisk support och som tillhandahåller material och utrustning för denna studie, och Alan Kelleher för teknisk support.
Detta arbete finansierades genom bidrag från University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), kan YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
Materials
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. . The Society. , (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M. Three-dimensional context regulation of metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).
