3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker
Summary
De processen die blaas kanker invasie vertegenwoordigen mogelijkheden voor biomerker en therapeutische ontwikkeling. Hier presenteren we een blaas kanker invasie model waarin 3D-cultuur tumor spheroïden, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie. Deze techniek is handig voor het definiëren van de kenmerken van de invasieve proces en voor het screenen van therapeutische agenten.
Abstract
Blaaskanker is een belangrijk gezondheidsprobleem. Er wordt geschat dat meer dan 16.000 mensen dit jaar in de Verenigde Staten van blaaskanker sterven zullen. Terwijl 75% van de kankers van de blaas zijn niet-invasieve en onwaarschijnlijk metastaseren, vooruitgang ongeveer 25% naar een invasieve groeipatroon. Bijna de helft van de patiënten met invasieve kankers Nieuwengels dodelijke metastatische herval. Inzicht in het mechanisme van invasieve progressie in blaaskanker is dus cruciaal voor patiëntenoutcomes voorspellen en voorkomen van dodelijke metastasen. In dit artikel presenteren we een driedimensionale kanker invasie model waarmee opneming van tumorcellen en stromale componenten na te bootsen in vivo omstandigheden die zich voordoen in de blaas tumor communicatie. Dit model biedt de mogelijkheid om te observeren de invasieve proces in real time via time-lapse imaging, ondervragen van de moleculaire pathways betrokken confocal immunefluorescentie beeldvorming en scherm verbindingen met het potentieel de invasie van het blok. Dit protocol is gericht op blaaskanker, is het waarschijnlijk dat soortgelijke methoden kunnen worden gebruikt om de invasie en beweeglijkheid in de tumor andersoortige ook onderzoeken.
Introduction
Invasie is een cruciale stap in de progressie van kanker, die is vereist voor metastase, en wordt geassocieerd met lagere overleven en slechte prognose bij patiënten. In menselijke blaaskanker, de meest voorkomende maligniteit van de urinewegen, waardoor ongeveer 165.000 sterfgevallen per jaar wereldwijd, zijn stadium van de kanker, de behandeling en de prognose direct gerelateerd aan de aanwezigheid of afwezigheid van invasie1. Ongeveer 75% van de gevallen van blaaskanker zijn niet-spier invasieve en worden beheerd met lokale resectie. In tegenstelling, spier-invasieve blaas kanker (ongeveer 25% van alle gevallen) zijn agressieve tumoren met een hoog metastatische en worden behandeld met agressieve multimodaliteit therapie2,3. Inzicht in de moleculaire wegen die leiden invasie tot is daarom essentieel beter karakteriseren het risico van invasieve progressie en het ontwikkelen van therapeutische interventies die invasieve progressie kunnen voorkomen.
Invasieve progressie van de tumor zich voordoet in een complexe driedimensionale (3-D) omgeving en vereist tumor cel interactie met andere tumorcellen, stroma, kelder membraan en andere soorten cellen, met inbegrip van immune cellen, fibroblasten, spiercellen en vasculaire endotheliale cellen. Doorlaatbare steun (b.v.Transwell) assay systemen zijn vaak aangewend om te kwantificeren kanker cel invasie4, maar deze systemen zijn beperkt omdat ze niet toestaan microscopisch kleine controle van het proces van de invasie in real-time en de ophalen van monsters voor verdere kleuring en moleculaire analyse is uitdagend. Ontwikkeling van een 3D-blaas tumor sferoïde systeem te bestuderen van de invasie is wenselijk omdat hierdoor de opname van gedefinieerde microenvironmental componenten met het gemak van in vitro -systemen.
In dit protocol, beschrijven we een systeem om te ondervragen van de invasieve processen van menselijke blaas kankercellen met behulp van een 3D-sferoïde invasie bepaling opnemen op basis van collageen gel matrices en confocale microscopie om onderzoekers te controleren van de beweeglijkheid van de cel en invasie inreal-time (Figuur 1). Dit systeem is veelzijdig en kan worden aangepast voor verschillende stromale tumor/instellingen ondervragen. Het kan de meeste blaas kanker cellijnen of primaire blaas tumoren en extra stromale cellen nemen zoals kanker geassocieerd fibroblasten en immuuncellen5,6,7. Dit protocol beschrijft een matrix bestaat uit collageen type-1, maar kan worden aangepast voor het nemen van andere moleculen zoals fibronectin, laminin of andere collageen-eiwitten. Invasieve processen kunnen worden gevolgd gedurende 72 uur of langer afhankelijk van de capaciteit van het systeem gebruikt en Microscoop. Fixatie en immunofluorescentie kleuring van de tumor die is ingesloten in de 3D-matrix vóór, tijdens en na de invasie kunt de ondervraging van upregulated van de eiwitten in invasieve cellen, waardoor cruciale informatie dat meestal afwezig of moeilijk te verzamelen met behulp van andere 3D-cultuur-modellen. Dit systeem kan ook worden gebruikt op scherm stoffen die het blokkeren van invasie, en af te bakenen signaalroutes beïnvloed door dergelijke verbindingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een 3D-tumor sferoïde model waarmee real-time opvolgen van blaas kanker invasie die essentieel is voor progressie van kanker en metastase. Dit systeem is vatbaar voor de integratie van verschillende stromale en cellulaire componenten waarmee onderzoekers aan betere recapituleren het weefsel communicatie waar blaas kanker invasie plaatsvindt. Blaas kanker spheroïden kan worden gegenereerd uit diverse bronnen zoals cellijnen (inclusief genetisch gemodificeerde cellijnen nuttig voor de behandeling van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank het laboratorium van Dr. Howard Crawford (University of Michigan) voor technische ondersteuning bieden materialen en apparatuur voor deze studie, en Alan Kelleher voor technische ondersteuning.
Dit werk werd gefinancierd door subsidies aan de University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3 NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
Materials
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. . The Society. , (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M. Three-dimensional context regulation of metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).
