تحديد وتوصيف النسيجي، وتشريح للماوس الفصوص البروستاتا لفي المختبر كروي 3D نماذج الثقافة
Summary
الفئران المهندسة وراثيا نماذج مفيدة للتحقيق وآليات سرطان البروستاتا. نقدم هنا بروتوكولا لتحديد وتشريح البروستاتا الفصوص من ماوس الجهاز البولي التناسلي والتفريق بينهم على أساس في علم الأنسجة، وعزل والثقافة خلايا البروستاتا الأولية في المختبر الماغنيسيوم لتحليلات المتلقين للمعلومات.
Abstract
نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمس) تكون بمثابة نماذج قبل سريرية فعالة للتحقيق في معظم أنواع السرطانات البشرية، بما في ذلك سرطان البروستاتا (PCa). فهم التشريح وعلم الأنسجة البروستاتا الماوس مهم لكفاءة استخدام والتوصيف الصحيح لمثل هذه النماذج الحيوانية. وقد البروستاتا الماوس أربع متميزة أزواج من الفصوص، كل منها خصائصها. يوضح هذا المقال الأسلوب السليم للتشريح وتحديد الماوس الفصوص البروستاتا لتحليل الأمراض. بعد التشريح، خلايا البروستات يمكن كذلك مثقف في المختبر لفهم الميكانيكية. منذ الماوس خلايا البروستات الابتدائية تميل إلى فقدان خصائصها الطبيعية عندما مثقف في المختبر، ونحن مخطط هنا طريقة لعزل الخلايا وتنمو كالثقافات كروي ثلاثي الأبعاد، والتي فعالة للحفاظ على الفسيولوجية خصائص الخلايا. يمكن استخدام هذه الثقافات ثلاثي الأبعاد لتحليل مورفولوجيا الخلايا ومستويات السلوك في ظروف قرب الفسيولوجية، والتحقيق في تعديل وتعريب البروتينات الرئيسية وسبل المشاركة في تنمية وتطور المرض، ويبحث في ردود على العلاج بالعقاقير.
Introduction
ما فتئت تسعى الأوساط العلمية توضيح الآلية المعقدة للتنمية البشرية السرطان لعدة عقود. حين يبدأ تحديد اللاعبين الرئيسيين المحتملين وأهداف المخدرات مع خلايا المريض ودراسات الأنسجة، تطبيق متعدية الجنسيات مثل هذه النتائج غالباً ما يتطلب استخدام نماذج حيوانية قبل الإكلينيكية. استخدام الفئران المهندسة وراثيا نماذج (جيممس) للسرطانات البشرية نموذج ارتفع مطردا منذ إقامة “الماوس نماذج من البشر سرطانات الكونسورتيوم” (NCI-ممهكك)، لجنة الذي سعى إلى وصف وتوحيد الصفات المميزة للسرطان الماوس نماذج للعلماء في جميع أنحاء العالم1،2. نماذج الماوس تفي بالحاجة إلى الدراسات الميكانيكية في الدراسات ما قبل السريرية لمعظم أنواع السرطان، فهم في التنمية، والتقدم، استجابة للعلاج، واكتسبت مقاومة3.
سرطان البروستات هو السرطان الأكثر شيوعاً التي تحدث في الرجال، والتي تؤثر على الرجال أكثر من 160,000 كل سنة4. أشكال عدوانية من المرض تدعي عشرات آلاف أرواح كل عام. ومع ذلك، هو ما زالت غير مفهومة إليه تطور المرض. ينتج عن هذا نقص خطير في خيارات علاج فعال لسرطان البروستاتا المتقدم والمنتشر، كما يدل على ذلك ارتفاع معدل الوفيات في مرضى سرطان البروستاتا المتقدم4. ومن ثم، هناك حاجة متزايدة لنماذج ما قبل السريرية لدراسة سرطان البروستاتا. ومع ذلك، نظراً للخلافات المتأصلة بين الماوس والبروستاتا البشرية، النمذجة لسرطان البروستاتا في جيمس لم يحظ شعبية حتى تطبيق نظام “التصنيف بار هاربور” في عام 2004، الذي أوجز تغييرات نسيجية في الماوس البروستاتا عند التلاعب بالجينات وتحديد التغيرات الورمية، وعلاقتها بمراحل تطور السرطان في البشر5. من الخصائص الهامة للبروستاتا الماوس التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند دراسة أي نموذج جيمم البروستاتا هو وجود أربع متميزة أزواج من الفصوص: الأمامي والجانبي والبطني والظهريه. يقدم الفصوص اختلافات كبيرة في الأنسجة والجينات نمط التعبير6. يمكن أن يختلف نمط التعبير البروتين بروباسين بين الفصوص في الشباب بعد سن البلوغ الفئران7، التي يجب مراعاتها منذ معظمها صممت النماذج المستندة إلى لجنة المساواة العرقية جيمم مروج المستندة إلى بروباسين باستخدام استدعاء Pb-Cre47. الاختلافات المكانية والزمانية الناتجة في التعبير لجنة المساواة العرقية غالباً ما تؤدي إلى الاختلافات في مواعيد بدء وتطور الورم، فضلا عن الاختلافات في التغيرات الورمية بين الفصوص. ومن ثم، فمن المهم مراعاة لمثل هذه الخلافات أثناء دراسة التنمية ورم في البروستاتا جيمس، والفصوص الفردية قد تحتاج إلى تقييم كل على حدة لتحقيق النتائج استنساخه. ويصف الجزء الأول من هذه المقالة الأساليب المناسبة تشريح البروستاتا ماوس، وتحديد وفصل كل الفص والاعتراف بالفروق في غذائها الفصوص.
بينما تحليل نمو الأورام والأنسجة يمكن أن توفر أفكاراً قيمة في تطوير الورم، أنها لا توفر الكثير من المعلومات عن الآليات الجزيئية. دراسة إليه الورم التنمية والتقدم وغالباً مفيدة لتحليل الخلايا السرطانية في المختبر. تم اقتراح عدة أساليب على مر السنوات التي تنطوي على الثقافات لهذه الخلايا، بما في ذلك تعليق الثقافات والثقافات 3D8 ، وفي الآونة الأخيرة، الثقافات 2D العادية9. بينما يؤدي معظم هذه الأساليب في معدلات البقاء على قيد الحياة وانتشار الخلايا جيدة، ثقافات 3D توفر بيئة الأقرب إلى الظروف الفسيولوجية. في الثقافات 3D أو كروي نمت في مصفوفة خارج الخلية غشاء الطابق السفلي (ECM)، والخلايا لومينال متمايزة تماما عادة ما يكون معدل بقاء منخفضة جداً؛ الخلايا القاعدية والوسيطة (معظمها الخلايا الجذعية) غير قادرة على نشر وإنتاج مجموعات الخلية تسمى الماغنيسيوم10. وهذا يجعلها مناسبة لدراسة سرطان منذ سرطان طلائي يعتقد أنها تنشأ من الخلايا الجذعية (المعروفة شعبيا باسم الخلايا الجذعية السرطانية)11. ويصف الجزء الثاني من هذا البروتوكول طريقة لاستزراع خلايا البروستات الماوس في الثقافات 3D. يمكن استخدامها في المجالات الناتجة عن ذلك لعدة أنواع من التحليلات المتلقين للمعلومات، بما في ذلك دراسة مورفولوجية أورجانويد والسلوك بخلية يعيش التصوير، الفلورة تلطيخ للبروتينات المختلفة، ودراسة الردود على العلاج الكيميائي العلاجات.
عموما، والهدف من هذا البروتوكول بيان الأساليب المثلى لاستخدام نماذج الماوس في سرطان البروستاتا بوصف تقنيات التشريح والتشريح البروستاتا الماوس وتجهيز الأنسجة للثقافات كروي وتحليلها في المختبر .
Protocol
Representative Results
Discussion
وتلخص هذه الورقة طرق تشريح البروستات الماوس وتحديد الهوية من الفصوص الفردية. ووصف أيضا هو بروتوكول لاستزراع خلايا البروستات الماوس في ثقافة 3D للتحليل في المختبر .
خطوة حاسمة في تشريح البروتوكول هو حصاد UGS كامل من الماوس (1) وفصل الأجهزة الفردية تحت مجهر تشريح. أنسجة البر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المنحة من المعهد الوطني للسرطان، R01CA161018 إلى LK.
Materials
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
- Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
- Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Society, A. C. . Cancer Facts and Figures. , (2018).
- Shappell, S. B., et al. Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).
- Hofner, T., et al. Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin. Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Clarke, M. F., Fuller, M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Colicino, E. G., et al. Gravin regulates centrosome function through PLK1. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).
- Ittmann, M., et al. Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O. Mouse models of prostate cancer. Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).
- Xiong, X., et al. Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice. Oncogenesis. 1, e26 (2012).
- Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells. Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).
