Identificación, caracterización histológica y disección de ratón próstata lóbulos para modelos In Vitro esferoide 3D cultura
Summary
Ratones modificados genéticamente son modelos útiles para la investigación de mecanismos del cáncer de próstata. Aquí presentamos un protocolo para identificar y disecar la próstata lóbulos de un mouse del Sistema urogenital, diferenciarlas basados en la histología y aislar y cultura primaria células prostáticas en vitro como esferoides para análisis posteriores.
Abstract
Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMMs) sirven como eficaces modelos preclínicos para investigar muchos tipos de cánceres humanos, incluido el cáncer de próstata (PCa). Comprender la anatomía y la histología de la próstata del ratón es importante para el uso eficiente y adecuada caracterización de dichos modelos animales. La próstata del ratón tiene cuatro distintos pares de lóbulos, cada uno con sus propias características. Este artículo muestra el método correcto de disección e identificación de lóbulos próstata mouse para el análisis de la enfermedad. Disección posterior, las células de la próstata pueden ser más culta en vitro para comprensión mecanicista. Desde el ratón próstata células primarias tienden a perder sus características normales cuando cultivo en vitro, esbozamos aquí un método para aislar las células y crecen como cultivos 3D esferoide, que es eficaz para preservar el fisiológico características de las células. Estas culturas 3D pueden utilizarse para analizar la morfología de la célula y los niveles de comportamiento en condiciones fisiológicas cerca, investigando alterado y localizaciones de proteínas clave y vías que intervienen en el desarrollo y la progresión de una enfermedad y mirando respuestas a tratamientos farmacológicos.
Introduction
La comunidad científica ha estado tratando de aclarar el complejo mecanismo de desarrollo de cáncer en humanos por décadas. Considerando que la identificación de potenciales actores y dianas farmacológicas comienza con estudios de tejido y células del paciente, la aplicación traslacional de tales hallazgos a menudo requiere el uso de modelos animales preclínicos. El uso de ratones modificados genéticamente modelos (GEMMs) a cánceres humanos modelo ha aumentado constantemente desde el establecimiento del ratón modelos de humano cánceres consorcio (NCI-MMHCC), una Comisión que pretendía describir y unificar las características del cáncer de ratón modelos para los científicos en todo el mundo1,2. Modelos de ratón satisfacen la necesidad de estudios mecanísticos en los estudios preclínicos de la mayoría de los tipos de cáncer, para entender el desarrollo, progresión, respuesta a tratamientos y adquirieron resistencia3.
El cáncer de próstata es el cáncer que ocurre más comúnmente en hombres, afectando a más de 160.000 hombres cada año4. Formas agresivas de la enfermedad dicen decenas de miles de vidas cada año. Sin embargo, el mecanismo de progresión de la enfermedad es todavía mal entendido. Esto resulta en una grave falta de opciones de tratamiento eficaz para cáncer de próstata avanzado y metastásico, como lo demuestra la alta tasa de mortalidad en pacientes de cáncer de próstata avanzado4. Por lo tanto, existe una creciente necesidad de modelos preclínicos estudiar el cáncer de próstata. Sin embargo, debido a las diferencias inherentes entre el ratón y el humano de la próstata, modelado del cáncer de próstata en GEMMs no ganó popularidad hasta que el sistema de clasificación de Bar Harbor fue introducido en 2004, que se describe cambios histopatológicos en el ratón próstata en manipulación genética, la identificación de cambios neoplásticos y su relación con las etapas de la progresión del cáncer en los seres humanos5. Una característica importante de la próstata del ratón que debe tenerse en cuenta al estudiar cualquier modelo de GEMM la próstata es la presencia de cuatro distintos pares de lóbulos: anterior, lateral, ventral y dorsal. Los lóbulos presentan diferencias significativas en la histopatología y gene expresión patrón6. Patrón de expresión de la proteína probasin puede variar entre los lóbulos en ratones jóvenes post pubertad7, que debe ser considerado ya que Cre de GEMM modelos están diseñados en su mayoría utilizando un promotor basada en probasin llamado Cre4 Pb7. Las diferencias espaciales y temporales resultantes en Cre expresión a menudo conducen a diferencias en los plazos de iniciación y progresión del tumor así como las diferencias en cambios neoplásicos entre los lóbulos. Por lo tanto, es importante tener en cuenta esas diferencias mientras estudiaba el desarrollo del tumor en la próstata GEMMs y los lóbulos individuales deben evaluarse por separado para lograr resultados reproducibles. La primera parte de este artículo describe los métodos apropiados para disecar una próstata de ratón, identificar y separar cada lóbulo y reconocer las diferencias histológicas entre los lóbulos.
Mientras que el análisis del crecimiento del tumor y la histopatología puede proporcionar información valiosa en el desarrollo del tumor, no brindan mucha información acerca de los mecanismos moleculares. Para estudiar el mecanismo de desarrollo del tumor y la progresión, a menudo es útil analizar el tumor las células in vitro. Varios métodos se han sugerido sobre los años que implican cultivos de estas células, incluyendo suspensión culturas, culturas 3D8 y recientemente, 2D regulares culturas9. Mientras que la mayoría de estos métodos resulta en tasas de supervivencia y proliferación celular bien, las culturas 3D proporcionan un entorno más cercano a las condiciones fisiológicas. En 3D o esferoide culturas cultivadas en una matriz extracelular (ECM) de la membrana basal, las células luminales completamente diferenciadas generalmente tienen muy baja tasa de supervivencia; sin embargo, las células basales e intermedias (sobre todo células) son capaces de difundir y producir racimos de célula llamados esferoides10. Esto hace conveniente para un estudio de cáncer ya que se creen que proceden de las células madre (popularmente conocidas como las células madre cancerosas)11los cánceres epiteliales. La segunda parte de este protocolo describe un método para el cultivo de las células de próstata mouse en culturas 3D. Las esferas resultantes se pueden utilizar para varios tipos de análisis de aguas abajo, incluyendo el estudio de la morfología de organoides y el comportamiento de células vivas imágenes, inmunofluorescencia, tinción de proteínas diferentes y el estudio de las respuestas a la quimioterapia tratamientos.
En general, el objetivo de este protocolo es exponer métodos óptimos para el uso de modelos de ratón en el cáncer de próstata mediante la descripción de las técnicas de disección y anatomía de la próstata del ratón y el procesamiento del tejido para análisis en vitro y esferoide culturas .
Protocol
Representative Results
Discussion
Este documento describe los métodos de disección de la próstata del ratón e identificación de los lóbulos individuales. También se describe, es el protocolo para el cultivo de células de próstata de ratón en una cultura 3D para análisis en vitro .
Un paso crítico en el protocolo de disección es cosechar el UGS todo fuera del ratón (1) y separar los órganos individuales bajo un microscopio de disección. El tejido de la próstata es muy pequeño y rodeado por el resto de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la beca del Instituto Nacional del cáncer, R01CA161018 de LK.
Materials
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
- Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
- Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Society, A. C. . Cancer Facts and Figures. , (2018).
- Shappell, S. B., et al. Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).
- Hofner, T., et al. Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin. Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Clarke, M. F., Fuller, M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Colicino, E. G., et al. Gravin regulates centrosome function through PLK1. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).
- Ittmann, M., et al. Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O. Mouse models of prostate cancer. Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).
- Xiong, X., et al. Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice. Oncogenesis. 1, e26 (2012).
- Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells. Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).
