Kimlik, histolojik karakterizasyonu ve için fare Vitro 3D küresel kültür modelleri prostat lob diseksiyonu
Summary
Genetik fareler prostat kanseri mekanizmaları araştıran için yararlı modellerdir. Burada bir fare ürogenital sistemden prostat loblar incelemek, Histoloji üzerinde göre ayırt etmek ve yalıtmak ve pulcuklarının aşağı akım analizleri için olarak birincil Prostat hücreleri vitro kültür için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Genetiği fare modelleri (GEMMs) en tip-in insan kanser, prostat kanseri (PCa) dahil olmak üzere araştırma için etkili önceden klinik modelleri olarak hizmet vermektedir. Anatomi ve histoloji fare prostat anlama, hayvan tür modeller uygun karakterizasyonu ve verimli kullanım için önemlidir. Fare prostat dört ayrı çift lob, her biri kendi özellikleri vardır. Bu makalede, diseksiyon uygun yöntem ve fare prostat lob hastalığı analiz için kimlik gösterilir. Sonrası diseksiyon, prostat hücreler kültürlü vitro mekanik anlamak için daha fazla olabilir. Fare beri prostat primer hücre normal özellikleri kaybolur gideriz ne zaman kültürlü vitro, biz anahat burada hücreleri izole ve onları fizyolojik korumak için etkili olduğu 3D küresel kültürler büyüyen bir yöntem hücre özellikleri. Bu 3D kültürler hücre morfolojisi ve değiştirilmiş davranışı soruşturma fizyolojik koşullarda düzeyleri ve yerelleştirmeler anahtar proteinlerin ve yollarının geliştirilmesinde rol ve hastalığın ilerleme çözümlemek ve bakmak için kullanılabilir ilaç tedavileri için yanıt.
Introduction
Bilimsel topluluk yıllardır insan kanseri gelişiminin karmaşık mekanizma aydınlatmak kurmaya çalışıyor. Oysa potansiyel anahtar oyuncular ve uyuşturucu hedefleri tanımlaması hasta hücre ve doku çalışmaları ile başlar, translasyonel uygulama gibi bulgular genelde önceden klinik hayvan modelleri kullanılmasını gerektirir. Genetik fareler modelleri (GEMMs) modeli insan kanser için fare modelleri, insan kanser Konsorsiyumu (ncı-MMHCC), hangi tarif ve fare kanser özellikleri birleştirmek için aranan bir komite kurulması beri sayısı giderek kullanımı modeller için bilim adamları Dünya çapında1,2. Fare modelleri mekanik çalışmalar kanser gelişme, ilerleme, yanıt-e doğru tedaviler, anlamak için çoğu türleri önceden klinik çalışmalarda ihtiyacını yerine getirmek ve direnç3satın aldı.
Prostat kanseri erkeklerde her yıl4üzerinde 160.000 erkekleri etkileyen en sık meydana gelen kanserdir. Hastalığın agresif formlarını on binlerce her yıl hayatını iddia. Ancak, hastalık progresyon mekanizma hala kötü anlaşılmaktadır. Etkili tedavi seçenekleri Gelişmiş ve metastatik prostat kanseri, yüksek ölüm oranı gelişmiş prostat kanseri hastalar4kanıtladığı gibi ciddi bir eksikliği sonuçlanır. Bu nedenle, prostat kanseri eğitim önceden klinik modeller için büyüyen bir ihtiyaç vardır. Bar Harbor sınıflandırma sistemi fare histopatolojik değişikliklerin anahatları 2004 ‘ te kullanılmaya başlanan kadar ancak, fare ve insan prostat arasında içsel farklılıklar nedeniyle modelleme GEMMs prostat kanserinin popülerlik elde değil Prostat genetik manipülasyon, neoplastik değişiklikler tanımlaması ve insanlar5ilerlemesinde kanseri aşamaları onların ilişkisi üzerine. Bir önemli herhangi bir prostat et modeli eğitim sırasında dikkate alınması gereken fare prostat özelliğidir lob dört ayrı çift varlığı: ön, yan, ventral ve dorsal. Loblar histopatoloji ve gen ifade deseni6önemli farklılıklar mevcut. Probasin protein ifade deseninin Cre tabanlı et modelleri çoğunlukla tasarlanmıştır beri hangi probasin tabanlı promotor kullanarak Pb-Cre47adı verilen düşünülmelidir genç sonrası ergenlik fareler7, loblar arasında değişebilir. Cre ifade kez ortaya çıkan kayma ve temporal farklılıkları tümör başlama ve ilerleme zaman çizelgeleri farklılıkları yanı sıra neoplastik değişiklikler farklılıkları loblar arasında yol. Bu nedenle, tümör geliştirme prostat GEMMs okurken bu tür farklılıklar için hesap önemlidir ve bireysel loblar tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için ayrı ayrı değerlendirilmesi gerekebilir. Bu makalenin ilk bölümünde bir fare prostat incelemek, tanımlamak ve her lob ayırmak ve loblar histolojik farklılıkları tanımak için uygun yöntemleri açıklar.
Tümör büyüme ve histopatoloji Analizi değerli tümör geliştirme kazandırabileceğini iken, onlar moleküler mekanizmaları hakkında çok fazla bilgi vermeyin. Tümör gelişimi ve ilerlemesi mekanizması çalışmaya, genellikle tümör hücreleri içinde vitroanaliz etmek yararlı olduğu. Birkaç yöntem süspansiyon kültürler, 3D kültürler8 de dahil olmak üzere bu hücreleri kültürleri içeren yıllar içinde tavsiye ettiler ve son zamanlarda, normal 2D9kültürler. Bu yöntemlerin çoğu iyi hücre hayatta kalma ve nükleer silahların yayılmasına karşı fiyatlarına neden ise 3D kültürler için fizyolojik şartlarda en yakın olan bir ortam sağlamak. Membran hücre dışı matriks (ECM) içinde yetiştirilen 3D veya küresel kültürlerde tamamen farklı luminal hücreleri genellikle çok düşük sağkalım oranı var; Ancak, Bazal ve orta düzey hücreleri (çoğunlukla kök hücre) yayar ve pulcuklarının10denilen hücre kümeleri oluşturmak edebiliyoruz. Epitel kanser kök hücreleri (halk kanser kök hücreleri da bilinen)11‘ den kaynaklanan inanılıyor bu yana bu bir kanser çalışma için uygun yapar. Bu iletişim kuralı ikinci bölümü 3D kültürlerde fare prostat hücre kültürü çalışmalarının bir yöntem açıklanır. Elde edilen küreler aşağı akım analizleri, insan organoid Morfoloji ve canlı hücre, farklı proteinler için boyama ayirt Imaging davranışı ve kemoterapötik yanıtlarını çalışmanın da dahil olmak üzere çeşitli türleri için kullanılabilir tedaviler.
Genel olarak, bu iletişim kuralının amacı fare prostat anatomi ve diseksiyon teknikleri ve küresel kültür ve vitro analiz için doku işleme açıklayarak prostat kanserinde fare modelleri kullanmak için en iyi yöntemleri anahat etmektir .
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu kağıt fare prostat diseksiyon ve bireysel loblar tanımlaması için yöntemleri özetlenmektedir. Ayrıca fare Prostat hücreleri vitro analiz için 3D bir kültür kültür protokolüdür.
Bir kritik diseksiyon Protokolü (1) fare dışında tüm UGS hasat ve diseksiyon mikroskop altında bireysel organları ayıran adımdır. Prostat doku çok küçük ve UGS geri kalanı ile çevrili; Böylece, tüm dört çift lob sağlam tedarik ederken doğrudan doğruya–dan vücut boşlu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Kanser Enstitüsü, R01CA161018 LK için hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
- Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
- Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Society, A. C. . Cancer Facts and Figures. , (2018).
- Shappell, S. B., et al. Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).
- Hofner, T., et al. Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin. Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Clarke, M. F., Fuller, M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Colicino, E. G., et al. Gravin regulates centrosome function through PLK1. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).
- Ittmann, M., et al. Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O. Mouse models of prostate cancer. Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).
- Xiong, X., et al. Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice. Oncogenesis. 1, e26 (2012).
- Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells. Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).
