Lentivirale Vector-gemedieerde gentherapie van hepatocyten Ex Vivo voor autologe transplantatie in varkens
Summary
Dit protocol is bedoeld voor het beschrijven van varkens hepatocyte isolatie en ex vivo gene levering om te genezen van modellen van metabole ziekten via cel autologe transplantatie. Hoewel dit model geniet van unieke voordelen die succesvolle therapie gunst, is de toepassing een relevante Stichting bijkomende ziekten en aanduidingen aan te pakken.
Abstract
Gentherapie is een ideale keuze om te genezen van vele aangeboren fouten van de stofwisseling van de lever. Ex-vivo, lentivirale vectoren hebben met succes gebruikt in de behandeling van vele hematopoietische ziekten bij de mens, als hun gebruik biedt stabiele transgenic expressie als gevolg van de vector vermogen om te integreren in het genoom van de gastheer. Deze methode blijkt de toepassing van ex vivo gentherapie van hepatocyten op een grote diermodel van erfelijke tyrosinemia type ik. Dit proces bestaat uit 1) isolatie van primaire hepatocyten van het autologe donor/ontvanger dier, 2) ex vivo gene levering via hepatocyte transductie met een lentivirale vector, en 3) autologe transplantatie van gecorrigeerde hepatocyten via portaal veneuze injectie. Succes van de methode is in het algemeen afhankelijk van efficiënte en steriele verwijdering van de lever resectie, zorgvuldige behandeling van het verwijderde exemplaar voor isolatie van levensvatbare hepatocyten voldoende voor opnieuw enten, hoge-percentage transductie van de geïsoleerde cellen, en aseptische chirurgische procedures hele om infectie te voorkomen. Technische storing op elk van deze stappen resulteert in lage rendement van levensvatbare getransduceerde hepatocyten voor autologe transplantatie of infectie van het dier donor/ontvanger. Het varken model van menselijke type 1 erfelijke tyrosinemia (HT-1) gekozen voor deze aanpak is uniek vatbaar voor dergelijke methode, aangezien zelfs een klein percentage van de engraftment van de gecorrigeerde cellen tot herbevolking van de lever met gezonde cellen op basis van een krachtige leiden zullen selectief voordeel ten opzichte van native-zieke hepatocyten. Hoewel de selectie van deze groei niet voor alle indicaties gelden zal, deze benadering is een Stichting voor uitbreiding naar andere indicaties en zorgt voor manipulatie van deze omgeving te pakken van bijkomende ziekten, zowel binnen de lever en daarbuiten, terwijl controle voor blootstelling aan virale vector en de mogelijkheid voor off-target toxiciteit en tumorigeniciteit.
Introduction
Aangeboren fouten van de stofwisseling van de lever is een familie van genetische ziekten die collectief maar liefst 1 in 800 levendgeborenen1 beïnvloeden. Veel van deze ziekten zijn enkel gen gebreken2 en functioneel kunnen worden genezen door de invoering van een enkele gecorrigeerde kopie van het betrokken gen in een voldoende aantal hepatocyten3. Het werkelijke percentage van hepatocyten die moeten worden gecorrigeerd door de ziekte4 varieert en is grotendeels afhankelijk van de aard van het eiwit het codeert, bijvoorbeeld, uitgescheiden eiwitten versus cytoplasmatische. In de meeste gevallen is de werkzaamheid van een behandeling van metabole ziekte gemakkelijk vehiculumcontrolegroep door de aanwezigheid van biomarkers vaak beschikbaar in de omloop.
HT-1 is een aangeboren afwijking van de stofwisseling van de lever die uit een defect in fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)5, de laatste enzymatische stap in tyrosine metabolisme6 voortvloeit. FAH-deficiëntie leidt tot de ophoping van giftige metabolieten in de lever die kan leiden tot acute insufficiëntie van de lever en dood of in de chronische vorm van de ziekte kan leiden tot levercirrose en hepatocellulaire carcinoom. De ziekte is klinisch beheerd door toediening van 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), een klein molecuul remmers van het enzym stroomopwaarts van FAH in het metabolisme van tyrosine. De ziekte biedt een ideale omgeving waarin aan gene therapie testmethoden, zoals succesvolle correctie van zelfs een klein aantal hepatocyten uiteindelijk in de herbevolking van de gehele lever met gecorrigeerde cellen in zowel de grote als de kleine dierlijke modellen resulteren zal 7 , 8. Dit komt doordat gecorrigeerd cellen hebben een diepe overleven voordeel ten opzichte van niet-gecorrigeerde cellen als gevolg van de accumulatie van toxische metabolieten in de laatste. Het verlies van niet-gecorrigeerde hepatocyten zorgt voor selectieve uitbreiding van gecorrigeerde hepatocyten consistent met het regeneratief vermogen van de lever. Behandeling kan gemakkelijk worden gevolgd door het meten van de afname van de circulerende tyrosine en succinylacetone niveaus na transplantatie.
Ter rechtvaardiging van het invasieve karakter van de procedure, waaronder een gedeeltelijke hepatectomy, moet het doel van deze aanpak een duurzaam genezen. Daarom, replicatie incompetente lentivirale vectoren worden gebruikt omdat zij stabiel in de hepatocyte genoom9zal integreren. waarborgen van de levering van de gecorrigeerde gen aan alle dochtercellen als de lever groeit en breidt ter vervanging van het snelle verlies van niet-gecorrigeerde cellen. Dit is gunstig over adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren, die voornamelijk bestaan als episomes die alleen kunnen worden doorgegeven aan een eencellige dochter tijdens de mitose10 waarbij u verliest geen effect van de therapie in een kwestie van weken.
Hoewel een groeiend lichaam van literatuur ondersteunt de veiligheidvan lentivirus11, zorgen zijn genotoxisch gebeurtenissen verzacht door de signaaltransductie van cellen van de gastheer voor een gecontroleerde in vitro milieu te beperken. Gratis vector wordt nooit systemisch geïntroduceerd op de host wanneer deze methode wordt uitgevoerd, beperking van de blootstelling aan de hepatocyten die weer opgenomen met autologe transplantatie via de portal ader worden zal.
Dit verslag beschrijft de methode van de chirurgische en ex vivo procedures gebruikt om hepatocyten voor gene therapie ex vivo en latere autologe transplantatie12 voor de behandeling van de HT-1 varken8te isoleren. Het volledige proces omvat 1) een gedeeltelijke hepatectomy dat als een bron van hepatocyten en een stimulans van de groei voor de host de lever, 2) isolatie van hepatocyten uit de verwijderde lever gevolgd door ex vivo gene correctie, en tenslotte 3) herinvoering van fungeert de gecorrigeerde hepatocyten terug naar de host. De beschreven methode is van toepassing op alle grote dierlijke modellen met enige aanpassing, maar alleen de FAH-deficiënte varken13 zal hebben het voordeel van de selectieve omgeving voor gecorrigeerde hepatocyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit verslag beschrijft een ex vivo autologe gene therapie aanpak om te genezen van een varkens model voor HT-1. Het gaat om een gedeeltelijke hepatectomy, gevolgd door ex vivo hepatocyte isolatie en transductie van geïsoleerde hepatocyten met lenti virus uitvoering van de corrigerende transgenic. Gecorrigeerde autologe hepatocyten worden vervolgens terug naar het dier FAH tekort via de portal vein8getransplanteerd. Hoewel de beschreven methode is van toepassing op alle grote die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Duane Meixner voor expertise in het uitvoeren van de portal-veneuze injectie, Steve Krage Joanne Pederson en Lori Hillin voor ondersteuning tijdens de chirurgische procedures. Dit werk werd gesteund door het Children’s Hospital of Minnesota Foundation en regeneratieve geneeskunde Minnesota. R.D.H. werd gefinancierd door middel van een NIH K01 DK106056 award en een Mayo kliniek centrum voor regeneratieve geneeskunde Career Development Award.
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
References
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S. Metabolic liver disease in children. Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
