Lentiviral vektör-aracılı gen terapisi tetkikine Ex Vivo domuz otolog nakli için
Summary
Bu iletişim kuralı modelleri otolog hücre transplantasyonu ile metabolik hastalıkların tedavisi için domuz hepatosit yalıtım ve ex vivo gen teslim açıklamak için tasarlanmıştır. Her ne kadar bu modelle başarılı terapi lehine benzersiz avantajlar sahiptir, uygulama ek hastalıklar ve göstergeler yönelik olarak ilgili bir temelidir.
Abstract
Gen tedavisi karaciğer metabolizmasının birçok doğuştan hataları tedavisi için ideal bir seçimdir. Ex vivo, lentiviral vektörler kullanılmıştır başarıyla insanlarda, hematopoetik birçok hastalığın tedavisinde kullanımları vector öğesinin ana bilgisayar genom entegre yeteneği nedeniyle istikrarlı transgene ifade sunduğundan. Bu yöntem ex vivo gen terapisi tetkikine, uygulamaya büyük bir hayvan modeli kalıtsal tyrosinemia türü gösterir ben. Bu işlem 1) birincil tetkikine otolog donör/alıcı hayvandan 2 yalıtım oluşur) bir lentiviral vektör ve düzeltilmiş tetkikine yolu ile taşınabilir 3) otolog nakli ile hepatosit iletim yoluyla ex vivo gen teslim Enjeksiyon damar. Başarı yöntemi genellikle karaciğer rezeksiyonu, uygun tetkikine izole hücreler yeniden engrafting, yüksek yüzdesi iletim için yeterli yalıtım için çıkarılan numune taşıma dikkatli verimli ve steril kaldırılması üzerine dayanır ve Aseptik cerrahi işlemler boyunca enfeksiyonu önlemek için. Bu adımlardan herhangi birini teknik başarısızlık otolog nakli için uygun transduced tetkikine düşük verim veya donör/alıcı hayvan enfeksiyonu neden olur. Düzeltilmiş hücre engraftment bile küçük bir yüzdesi için karaciğer repopulation sağlıklı hücreler üzerinde güçlü bir temel sağlayacaktır gibi domuz insan tipi 1 kalıtsal tyrosinemia (HT-1) Bu yaklaşım için seçilen benzersiz olarak böyle bir yönteme mükellef modeldir yerli hastalıklı tetkikine seçici avantaj. Bu büyüme seçimi için tüm göstergeler gerçek olmayacak olsa da, bu yaklaşım diğer göstergeler doğru genişleme için bir temel ve ek hastalıklar, her ikisi de karaciğer içinde adres ve ötesinde, süre için bu ortamda manipülasyon için sağlar viral vektör ve hedef kapalı toksisite ve tumorigenicity için fırsat maruz için kontrol etmek.
Introduction
Karaciğer metabolizmasının doğuştan hataları topluca 1 800 canlı Doğum1en çok etkileyen genetik hastalıkların bir aileyiz. Çoğu bu hastalıkların tek gen kusurları2 ve işlevsel olarak etkilenen gen tek bir düzeltilmiş kopyasını tetkikine3yeterli sayıda tanıtarak tedavi edilebilir. Düzeltilmesi gereken tetkikine gerçek yüzdesi hastalığı4 tarafından değişir ve büyük ölçüde bu kodlar, örneğin, atılan protein karşı sitoplazmik protein niteliğine bağlıdır. Çoğu durumda, herhangi bir tedavi etmek için metabolik etkinliğini kolayca aracılığıyla biyolojik dolaşımda bulunan çoğu kullanılabilir varlığı denetlesinler.
HT-1 sonuç fumarylacetoacetate hidrolaz (FAH)5bir üründe, Tirozin metabolizma6enzimatik son adımda karaciğer metabolizmasının doğuştan bir hatadır. FAH eksikliği için sürüme akut karaciğer yetmezliğine ve ölüme neden olabilir veya hastalık kronik şeklinde siroz ve hepatosellüler karsinom neden olabilir karaciğerde toksik metabolitleri, uzun ve zorludur. Hastalığın klinik olarak 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), küçük molekül inhibitörü olan bir enzim akıntıya karşı FAH, Tirozin metabolizması İdaresi tarafından yönetilir. Gibi başarılı tetkikine bile az sayıda düzeltilmesi hem küçük hem de büyük hayvan modellerinde düzeltilmiş hücrelerle sonunda tüm karaciğer repopulation içinde sonuçlanır hastalık hangi gen tedavi yöntemleri, test etmek ideal bir ortam sağlar 7 , 8. bu düzeltilmiş için hücreleri var toksik metabolitleri birikimi nedeniyle düzeltilemeyen hücreleri üzerinde derin hayatta kalma avantaj ikincisi oluşur. Düzeltilmemiş tetkikine kaybı düzeltilmiş tetkikine seçici genişleme için karaciğer yeniden üretim kapasitesi ile tutarlı sağlar. Tedavi kolayca nakli takip tirozin ve succinylacetone düzeyleri dolaşan içinde azalma ölçerek izlenebilir.
Kısmi bir hepatectomy içerir, yordam, invaziv doğası haklı göstermek için bu yaklaşım amacı dayanıklı bir tedavi olmalı. Bu nedenle, stabil hepatosit genom9içine entegre olacak çünkü çoğaltma beceriksiz lentiviral vektörler kullanılır. karaciğer olarak tüm kızı hücreleri için düzeltilmiş gen teslim sağlanması büyür ve düzeltilmeyen hücrelerinin hızlı kaybı değiştirmek için genişler. Bu sadece tek bir kızı hücre mitoz10 böylece herhangi bir etkisi birkaç hafta içinde tedavisinin kaybetme sırasında geçirilen episomes olarak öncelikle mevcut ilişkili adeno virüs (AAV) vektörler üzerinde avantajlıdır.
Edebiyat büyüyen bir vücut üzerinde lentivirus11, endişeleri Emanet desteklese genotoksik olaylar kontrollü vitro ortama konak hücreleri iletim sınırlayarak hafifletilmiş. Bu yöntem gerçekleştirildiğinde portal ven yoluyla otolog nakli ile yeniden kullanılmaya olacak tetkikine maruz sınırlayan ücretsiz vektör asla sistemik ana bilgisayara giriliyor.
Bu rapor cerrahi yöntemin ve gen terapisi ex vivo için tetkikine ve sonraki otolog transplantasyon12 HT-1 domuz8tedavisi için ayırmak için kullanılan ex vivo yordamlar açıklanmaktadır. Tam işlem tetkikine ve bir ana bilgisayarın karaciğer için büyüme uyarıcı bir kaynak, 2) ardından ex vivo gen düzeltme ve son olarak 3) reintroduction eksize karaciğer üzerinden tetkikine yalıtım olarak hizmet veren 1) bir kısmi hepatectomy içerir düzeltilmiş tetkikine ev sahibi geri. Açıklanan yöntemi bazı değişiklik ile tüm büyük hayvan modeller için geçerlidir ama sadece FAH eksikliği domuz13 seçici çevre düzeltilmiş tetkikine için avantaj olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu rapor bir domuz model HT-1’in tedavi bir ex vivo otolog gen terapisi yaklaşım açıklar. Ex vivo hepatosit yalıtım ve izole tetkikine iletim düzeltici transgene taşıyan lenti virüsle ardından kısmi bir hepatectomy içerir. Düzeltilmiş otolog tetkikine sonra geri FAH eksik hayvan ile portal ven8nakledilmektedir. Açıklanan yöntemi bazı değişiklik ile tüm büyük hayvan modelleri için geçerli olsa da, FAH eksikliği domuz için düzeltilmiş hücreleri<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Duane Meixner destek için gösteri cerrahi işlemler sırasında portal ven enjeksiyon, Steve Krage, Joanne Pederson ve Lori Hillin uzmanlık için teşekkür ederiz. Bu eser Çocuk Hastanesi Minnesota Vakfı ve rejeneratif tıp Minnesota tarafından desteklenmiştir. R.D.H. rejeneratif tıp kariyer geliştirme Ödülü NIH K01 DK106056 ödül ve bir Mayo Kliniği Merkezi üzerinden finanse edildi.
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
References
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S. Metabolic liver disease in children. Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
