Des gènes induite par le vecteur de la thérapie génique des hépatocytes Ex Vivo pour Transplantation autologue chez le porc
Summary
Ce protocole vise à décrire l’isolement et ex vivo livraison de gène porcin hépatocytes pour guérir des modèles de maladies métaboliques par autogreffe de cellules. Bien que ce modèle particulier bénéficie d’avantages uniques qui favorisent une thérapie réussie, l’application est une base pertinente pour traiter les indications et autres maladies.
Abstract
La thérapie génique est un choix idéal pour soigner les nombreuses erreurs innées du métabolisme du foie. Ex vivo, vecteurs LENTIVIRAUX ont été utilisées avec succès dans le traitement de nombreuses maladies hématopoïétiques chez l’être humain, car leur utilisation offre l’expression TRANSGENIQUE stable en raison de la capacité du vecteur d’intégrer dans le génome hôte. Cette méthode illustre l’application de la thérapie génique ex vivo des hépatocytes à un grand modèle animal de la tyrosinémie héréditaire de type I. Ce processus se compose de 1) isolation des hépatocytes primaires de l’animal donneur/receveur autologue, 2) ex vivo la livraison de gène par l’intermédiaire de transduction d’hépatocytes avec un vecteur lentiviral et greffe 3) autologue des hépatocytes corrigés via portail injection de la veine. Succès de la méthode s’appuie généralement sur une suppression efficace et stérile de la résection hépatique, prudente, manipulation de l’échantillon excisé, isolation des hépatocytes viables permettant de re-après, le pourcentage élevé de transduction des cellules isolées, et procédures chirurgicales aseptiques partout pour prévenir l’infection. Une défaillance technique à n’importe lequel de ces étapes se traduira par le faible rendement des hépatocytes de transduite viables pour greffe autologue ou infection de l’animal donneur/receveur. Le modèle de cochon de tyrosinémie héréditaire de type humain 1 (HT-1) choisi pour cette approche est particulièrement favorable à une telle méthode, car même un faible pourcentage de prise de greffe de cellules corrigées conduira au repeuplement du foie avec des cellules saines, basés sur un puissant avantage sélectif sur les hépatocytes natif-malades. Bien que cette sélection de croissance ne sera pas vraie pour toutes les indications, cette approche est une Fondation pour l’expansion dans d’autres indications et permet pour la manipulation de cet environnement pour traiter des maladies supplémentaires, tant à l’intérieur du foie et au-delà, tout en contrôle d’exposition aux vecteurs viraux et possibilité de toxicité hors cible et de la tumorigénicité.
Introduction
Erreurs innées du métabolisme du foie sont une famille de maladies génétiques affectant collectivement autant que 1 dans 800 naissances vivantes1. Nombre de ces maladies sont monogéniques défauts2 et peuvent être fonctionnellement guéries en introduisant une seule copie corrigée du gène affecté dans un nombre suffisant d’hépatocytes3. Le pourcentage réel d’hépatocytes qui doit être corrigée varie selon la maladie4 et est largement tributaire de la nature de la protéine qu’il encode, par exemple, les protéines sécrétoires versus cytoplasmique. Dans la plupart des cas, l’efficacité d’un traitement pour une maladie métabolique est facilement dosée par la présence de biomarqueurs souvent disponibles dans la circulation.
HT-1 est une erreur innée du métabolisme du foie qui résulte d’un défaut de fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)5, la dernière étape enzymatique dans le métabolisme de la tyrosine6. Carence en FAH mène à l’accumulation de métabolites toxiques dans le foie qui peut causer la mort et insuffisance hépatique aiguë ou dans la forme chronique de la maladie peut provoquer une cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Cliniquement, la maladie est gérée par l’administration de 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), un inhibiteur d’une enzyme en amont de FAH dans le métabolisme de la tyrosine de petite molécule. La maladie fournit un environnement idéal permettant de tester les méthodes de thérapie génétique, comme correction réussie de même un petit nombre des hépatocytes entraînera finalement le repeuplement du foie entier avec cellules corrigées dans des modèles animaux petits et grands 7 , 8. cela se produit car le corrigé, les cellules ont un avantage de survie profond sur des cellules non corrigés en raison de l’accumulation de métabolites toxiques dans ce dernier. La perte des hépatocytes non corrigés permet une expansion sélective des hépatocytes corrigées compatible avec la capacité de régénération du foie. Traitement peut être facilement suivie en mesurant la diminution des taux de tyrosine et succinylacetone TRANSPLATATION circulants.
Afin de justifier le caractère invasif de la procédure, qui comprend une hépatectomie partielle, l’objectif de cette approche doit être un remède durable. Vecteurs LENTIVIRAUX incompétent de réplication ne sont donc utilisés parce qu’ils intégreront stablement dans l’hépatocyte génome9. assurer la prestation du gène a été corrigé à toutes les cellules de fille comme le foie se développe et s’agrandit pour remplacer la perte rapide de cellules non corrigés. C’est avantageux sur les vecteurs viraux adéno associé (AAV), qui existe principalement extrachromosomale ne pouvant être transmises à une seule cellule fille au cours de la mitose10 , perdant ainsi tout effet de la thérapie en quelques semaines.
Bien qu’un nombre croissant de publications prend en charge la sécurité des lentivirus11, préoccupations sur événements génotoxiques sont atténués en limitant la transduction des cellules de l’hôte dans un environnement contrôlé en vitro . Vecteur libre n’est jamais systémique introduit à l’hôte lorsque cette méthode est exécutée, limiter l’exposition aux hépatocytes qui sera réintroduit avec greffe autologue via la veine porte.
Ce rapport décrit la méthode de l’intervention chirurgicale et ex vivo les procédures utilisées pour isoler les hépatocytes pour la thérapie génique ex vivo et transplantation autologue ultérieure de12 pour le traitement de la HT-1 cochon8. Le processus complet comprend 1) une hépatectomie partielle qui sert de source d’hépatocytes et une stimulation de la croissance pour du foie de l’hôte, 2) isolation des hépatocytes du foie excisés suivie ex vivo correction de gène et enfin 3) la réintroduction de la hépatocytes corrigés de nouveau dans l’hôte. La méthode décrite est applicable à tous les grands modèles animaux avec quelques modifications, mais seulement la FAH-deficient cochon13 aura l’avantage du milieu sélectif pour les hépatocytes corrigées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le présent rapport décrit une approche ex vivo gène autologue thérapie pour guérir un modèle porcin de HT-1. Il s’agit d’une hépatectomie partielle, suivie par ex vivo d’isolement de l’hépatocyte et transduction d’hépatocytes isolés avec lenti virus transportant le transgène correctif. Corrigée des hépatocytes autologues sont alors transplantés vers l’animal déficient FAH par l’intermédiaire de la veine porte8. Bien que la méthode décrite est appli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Duane Meixner pour expertise dans l’exécution de l’injection de la veine porte, Steve Krage, Joanne Pederson et Lori Hillin soutien pendant les interventions chirurgicales. Ce travail a été soutenu par la Fondation de l’hôpital du Minnesota et la médecine régénérative Minnesota enfants. R.D.H. a été financé par un prix de NIH K01 DK106056 et un centre de clinique de Mayo pour la médecine régénérative Career Development Award.
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
References
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