Lentiviral Vector-medierad genterapi av hepatocyter Ex Vivo för autolog Transplantation hos svin
Summary
Detta protokoll syftar till att beskriva svin hepatocyte isolering och ex vivo gen leverans för att bota modeller av metabola sjukdomar via autolog stamcellstransplantation. Även om just denna modell har unika fördelar som gynnar framgångsrik terapi, är ansökan en relevant grund att ta itu med ytterligare sjukdomar och beteckningar.
Abstract
Genterapi är ett perfekt val att bota många medfödda metabolism i levern. Ex-vivo, lentiviral vektorer har framgångsrikt använts i behandlingen av många hematopoetiska sjukdomar hos människor, eftersom deras användning erbjuder stabil transgenens uttryck vektorn förmåga att integrera i värd genomet. Denna metod visar tillämpningen av ex vivo genterapi av hepatocyter på en stor djurmodell av hereditär tyrosinemi typ jag. Denna process består av 1) isolering av primära hepatocyter från autologa givare/mottagare djuret, 2) ex vivo gen leverans via hepatocyte transduktion med lentiviral vector och 3) autolog transplantation av korrigerade hepatocyter via portalen ven injektion. Framgången med metoden generellt bygger på effektiv och sterila borttagning av den levern resektion, noggrann hantering av exciderad förlagan för isolering av livskraftiga hepatocyter tillräckligt för åter implantation, hög andel transduktion i isolerade celler, och aseptiska kirurgiska ingrepp hela tiden för att förhindra infektion. Tekniskt fel på någon av dessa steg kommer att resultera i låg avkastning av livskraftiga sensorik hepatocyter för autolog transplantation eller infektion av givare/mottagare djuret. Gris modellen av människans typ 1 hereditär tyrosinemi (HT-1) valt för detta synsätt är unikt mottagliga för denna metod, eftersom även en liten andel av engraftment av korrigerade celler kommer att leda till återinsättning av levern med friska celler baserat på en kraftfull selektiv fördel över native-sjuka hepatocyter. Även om denna tillväxt urval inte kommer vara sant för alla indikationer, detta tillvägagångssätt är en stiftelse för expansion till andra indikationer och tillåter manipulering av denna miljö att ta itu med ytterligare sjukdomar, både i levern och bortom, medan Kontrollera för exponering för virala vektorn och möjlighet för off-target toxicitet och tumorigenicitetsprov.
Introduction
Medfödda rubbningar i ämnesomsättningen i levern är en familj av genetiska sjukdomar som kollektivt påverkar så många som 1 i 800 levande födda1. Många av dessa sjukdomar är enda gen defekter2 och funktionellt kan botas genom att införa en enda korrigerad kopia av drabbade genen i ett tillräckligt antal hepatocyter3. Den faktiska procentuella hepatocyter som måste rättas varierar av sjukdom4 och är till stor del beroende på vilken typ av protein det kodar, exempelvis utsöndras proteinerna kontra cytoplasmiska. I de flesta fall är effekten av någon behandling för metabola sjukdomar enkelt analyseras genom närvaron av biomarkörer ofta tillgängliga i cirkulationen.
HT-1 är ett medfött fel av metabolism i levern som resulterar från en defekt i fumarylacetoacetathydrolas hydrolas (FAH)5, sista enzymatiska steg i tyrosin metabolism6. FAH-brist leder till att bygga upp av toxiska metaboliter i levern som kan orsaka akut leversvikt och död eller i den kroniska formen av sjukdomen kan orsaka skrumplever och Hepatocellulär cancer. Sjukdomen är kliniskt förvaltas av administration av 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), en liten molekyl hämmare av ett enzym uppströms av FAH i tyrosin metabolism. Sjukdomen ger en idealisk miljö att testa genterapimetoder, eftersom framgångsrika korrigering av även ett litet antal hepatocyter kommer så småningom leda till återinsättning av hela levern med korrigerade celler i både små och stora djurmodeller 7 , 8. Detta beror på att korrigeras celler har en djupgående överlevnadsfördel över okorrigerad celler på grund av ansamling av toxiska metaboliter i den senare. Förlusten av okorrigerad hepatocyter tillåter selektiv expansion av korrigerade hepatocyter konsekvent med regenerativ kapacitet av levern. Behandling kan enkelt följas genom mätning av minskningen av cirkulerande tyrosin och succinylaceton nivåer efter transplantation.
För att motivera den invasiva karaktären av förfarandet, som omfattar en partiell hepatectomy, måste målet för denna strategi vara ett varaktigt botemedel. Replikering inkompetenta lentiviral vektorer används därför eftersom de stabilt kommer att integreras i den hepatocyte genom9. att säkerställa leverans av korrigerade genen till alla dotterceller som levern växer och expanderar för att ersätta den snabb förlusten av okorrigerad celler. Detta är fördelaktigt över adeno associerade virala vektorer (AAV), som främst finns som episomes som kan endast skickas till en enda dotter cell under Mitos10 därmed förlora någon effekt av terapin i några veckor.
Även om en växande mängd litteratur stöder säkerhet lentivirus11, oro över mildras genotoxiska händelser genom att begränsa transduktion av värdceller till en kontrollerad in vitro- miljö. Gratis vektor introduceras aldrig systemiskt till värden när denna metod utförs, begränsa exponering för de hepatocyter som kommer att återinföras med autolog transplantation via portalen ven.
Denna rapport beskriver metoden för den kirurgiska och ex vivo förfaranden som används för att isolera hepatocyter för gen terapi ex vivo och efterföljande autolog transplantation12 för behandling av HT-1 gris8. Hela processen inkluderar 1) en partiell hepatectomy som fungerar som en källa av hepatocyter och en tillväxt stimulans för värdens levern, 2) isolering av hepatocyter från exciderad levern följt av ex vivo gen korrigering, och slutligen 3) återinförandet av den korrigerade hepatocyter tillbaka till värden. Den beskrivna metoden är tillämplig på alla stora djurmodeller med några ändringar, men endast FAH-brist gris13 kommer att ha fördelen av selektiv miljön för korrigerade hepatocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna rapport beskriver en ex vivo autolog gen terapi metod för att bota en svin modell av HT-1. Det handlar om en partiell hepatectomy, följt av ex vivo hepatocyte isolering och transduktion av isolerade hepatocyter med lenti virus bär den korrigerande transgenens. Korrigerade autolog hepatocyter transplanteras sedan tillbaka till FAH bristfällig djuret via portvenen8. Även om den beskrivna metoden är tillämplig på alla stora djurmodeller med några ändringar, har FAH-b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Duane Meixner för expertis inom utför den portalen ven injektion, Steve Krage, Joanne Pederson och Lori Hillin för stöd under de kirurgiska ingrepp. Detta arbete stöds av Children’s Hospital of Minnesota Foundation och regenerativ medicin Minnesota. R.D.H. finansierades genom en NIH K01 DK106056 utmärkelse och en Mayo Clinic Center för regenerativ medicin karriär Development Award.
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
References
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S. Metabolic liver disease in children. Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
