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Bioengineering

Generazione di nanoliposomi cationici per la consegna efficiente In Vitro di trascritti di RNA messaggero

Published: February 01, 2019
doi:
10.3791/58444
, , , , , , ,
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory,University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology,Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine,Monash University

Summary

Qui descriviamo un protocollo per la generazione di nanoliposomi cationici, che si basa sul metodo a secco-pellicola e possono essere utilizzato per la cassaforte e consegna efficiente in vitro di trascritti di RNA messaggero.

Abstract

Lo sviluppo di RNA messaggero (mRNA)-base terapeutica per il trattamento di varie malattie diventa sempre più importante a causa del positivo proprietà in vitro di trascritti di mRNA (IVT). Con l’aiuto di IVT mRNA, la sintesi de novo di una proteina desiderata può essere indotta senza modificare lo stato fisiologico della cellula bersaglio. Inoltre, biosintesi della proteina può essere controllato proprio a causa dell’effetto transitorio di IVT mRNA.

Per l’efficiente transfezione delle celle, nanoliposomi (NLps) possono rappresentare un veicolo di consegna sicura ed efficiente per mRNA terapeutico. Questo studio descrive un protocollo per generare sicura ed efficiente cationici NLps costituito da DC-colesterolo e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) come un vettore di consegna di IVT mRNA. NLps avendo una definita dimensione, una distribuzione omogenea e una capacità di complessazione alta e può essere prodotto utilizzando il metodo di film secco. Inoltre, presentiamo sistemi di prova differenti per analizzare loro complessazione ed efficacies di transfezione utilizzando sintetico enhanced proteina fluorescente verde (eGFP) mRNA, come pure il loro effetto sulla vitalità cellulare. Nel complesso, il protocollo presentato fornisce un approccio efficace e sicuro per complessazione di mRNA, che può progredire e migliorare l’amministrazione di mRNA terapeutico.

Introduction

L’uso di mRNA modificate per applicazioni terapeutiche ha dimostrato grandi potenzialità nell’ultimo paio di anni. Nelle malattie cardiovascolari, infiammatorie e monogenetica, così come lo sviluppo di vaccini, mRNA è un agente terapeutico promettente1.

Terapia sostitutiva della proteina con mRNA offre diversi vantaggi rispetto alla terapia genica classica, che si basa sulla transfezione del DNA nelle cellule bersaglio2. La funzione di mRNA avvia direttamente nel citosol. Anche se il plasmide DNA (pDNA), un costrutto di double-stranded, circolare DNA che contiene una regione di promotore e una sequenza del gene che codifica la proteina terapeutica3, anche atti nel citosol, può solo essere incorporata nelle cellule che stanno attraversando la mitosi al momento della trasfezione. Questo riduce il numero delle cellule transfettate in tessuto1,4. In particolare, la transfezione di tessuti con attività debole mitosi, come cellule cardiache, è difficile5. A differenza di pDNA, la transfezione e la traduzione di mRNA si verificano nelle cellule mitotiche e non-mitotica in tessuto1,6. L’integrazione virale del DNA nel genoma ospite può venire con effetti mutageni o reazioni immunitarie7,8, ma dopo la trasfezione di cellule con una codifica della proteina mRNA, la sintesi de novo della proteina voluta inizia in modo autonomo9,10. Inoltre, la sintesi delle proteine può essere regolata precisamente alla necessità del paziente attraverso dosi individuali, senza interferire con il genoma e rischiare gli effetti mutageni11. Il potenziale d’attivazione immunitaria del mRNA sinteticamente generato potrebbe essere drasticamente abbassato utilizzando pseudo-uridina e 5′-methylcytidine invece di uridina e citidina12. Pseudo-uridina modificate mRNA inoltre è stato indicato per avere una maggiore stabilità biologica e una significativamente più alta capacità traslazionale13.

Per poter beneficiare delle proprietà promettenti di terapia a base di mRNA in applicazioni cliniche, è essenziale per creare un veicolo adatto per il trasporto del mRNA nella cellula. Questo veicolo dovrebbe sopportare non tossico proprietà in vitro e in vivo, proteggere il mRNA contro nucleasi-degradazione e fornire sufficiente assorbimento cellulare per una disponibilità prolungata e la traduzione del mRNA14.

Tra tutti i tipi di vettore possibile per in vivo somministrazione di farmaci, quali nanotubi di carbonio, punti quantici e liposomi, quest’ultimo è stati studiati più di15,16. I liposomi sono vescicole costituito da un doppio strato di lipidi10. Sono anfifiliche con un idrofobo e una sezione idrofila, e attraverso l’auto-organizzazione di queste molecole, un doppio strato sferico è formata17. All’interno di liposomi, agenti terapeutici o farmaci possono essere incapsulati e, così, protetti dalla degradazione enzimatica18. Liposomi contenenti N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium cloruro (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propano] (DOTAP)20e dioctadecylamidoglycylspermine (cani)21, o DC-colesterolo22, sono ben caratterizzati e frequentemente utilizzati per la transfezione cellulare con DNA o RNA.

Liposomi cationici comprendono un caricato positiva del lipido e un fosfolipide uncharged23. Transfezione tramite liposomi cationici è uno dei metodi più comuni per il trasporto di acidi nucleici in cellule24,25. Le particelle di lipide cationico formano complessi con i gruppi fosfato negativamente caricato nella spina dorsale di molecole di acido nucleico26. Questi cosiddetti lipoplessi attaccare alla superficie della membrana cellulare ed entrano nella cellula tramite endocitosi o meccanismi di endocitosi-come27.

Nel 1989, Malone et al. descritto con successo mediata dei lipidi cationici mRNA transfezione28. Tuttavia, utilizzando una miscela di DOTMA e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), il gruppo ha trovato che DOTMA manifestato effetti citotossici28. Inoltre, Zohra et al hanno dimostrato che DOTAP (cloruro di 1,2-dioleoyloxy-3-trimetilammonio-propano) può essere utilizzato come un reagente di transfezione mRNA29. Tuttavia, per l’efficiente transfezione delle celle, DOTAP dovrebbe essere usato in combinazione con altri reagenti, come fibronectina29 o DOPE30. Finora, DOTMA era il primo lipide cationico sul mercato utilizzato per la consegna di gene31. Altri lipidi sono usate come supporto terapeutico o vengono testati in diverse fasi della sperimentazione clinica, (ad es., EndoTAG-I, contenente DOTAP come un elemento portante del lipido), è attualmente oggetto di indagine in un trial clinico di fase-II32.

Questo lavoro descrive un protocollo per la generazione di NLps contenente DC-colesterolo e DOPE. Questo metodo è facile da eseguire e permette la generazione di NLps di diverse dimensioni. L’obiettivo generale di generazione di NLp utilizzando il metodo a secco-pellicola è quello di creare liposomi per complessazione di mRNA, consentendo così efficiente e biocompatibile cellula trasfezione in vitro14,33.

Protocol

1. generazione di nanoliposomi cationici (Figura 1) Sciogliere i lipidi DC-colesterolo (3beta – cloridrato di colesterolo [N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoil]) e DOPE (dioleoyl phosphatidylethanolamine), consegnato sotto forma di polvere, in cloroformio per ottenere una concentrazione finale di 25 mg/mL.Nota: Conservare i lipidi disciolti a-20 ° C. Lavorare con 25 mg/mL di soluzione madre di entrambi i lipidi. Mix 40 µ l del disciolto DC-colesterolo e 80 µ…

Representative Results

Utilizzando il protocollo come descritto, NLps consistente dei lipidi DC-colesterolo e DOPE sono state preparate utilizzando il metodo di film secco (Figura 1). Durante la preparazione, la soluzione di nanoliposome Mostra diverse fasi di torbidità (Figura 2). L’efficacia di incapsulamento del NLps può quindi essere analizzato dopo l’incapsulamento di 1 µ g di mRNA co…

Discussion

Il protocollo presentato descrive la generazione di NLps con efficacia elevata incapsulamento per mRNA sinteticamente modificate, così come la transfezione affidabile di cellule in vitro. Il NLps, inoltre, garantiscono il rilascio di mRNA, che a sua volta, si traduce in una proteina funzionale all’interno delle cellule. Inoltre, le transfezioni utilizzando NLps possono essere eseguite a mezzo cellulare regolare, conseguente alta cella viabilità durante transfezione e durare fino a tre giorni dopo la trasfezion…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nessuno

Materials

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) AppliChem, Darmstadt, Germany A2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) Avanti, Alabama, USA 700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany D1306
BD FACScan system BD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 340181
Chloroform Merck, Darmstadt, Germany 102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany 20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti, Alabama, USA 850725
Fluorescence microscope Zeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11668019
Mini extruder Avanti, Alabama, USA
Nuclease-free water Qiagen, Hilden, Germany 129114
Opti-Mem Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany Q33140
RPMI (w/o phenol red) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11835030
Silica gel Carl Roth, Karlsruhe, Germany P077
Trypsin/EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 25300054
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen, Hilden, Germany 202602
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Germany 28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		 TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1014
Cyanine 3-CTP PerkinElmer, Baesweiler, Germany NEL580001EA
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany AM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs, Ipswich, USA S1411L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Ipswich, USA M0289S
Agarose Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 16500-500
GelRed Biotium, Fremont, USA 41003
peqGOLD DNA ladder mix VWR, Pennsylvania, USA 25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder Fisher Scientific, Göteborg,
Sweden		 11528766
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Michel, T., Link, A., Abraham, M., Schlensak, C., Peter, K., Wendel, H., Wang, X., Krajewski, S. Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA. J. Vis. Exp. (144), e58444, doi:10.3791/58444 (2019).
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