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Bioengineering

Geração de Nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de In Vitro transcrito de RNA mensageiro

Published: February 01, 2019
doi:
10.3791/58444
, , , , , , ,
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory,University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology,Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine,Monash University

Summary

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de nanoliposomes catiônico, o qual se baseia o método seco-filme e pode ser usado para o cofre e entrega eficiente do in vitro transcrito de RNA mensageiro.

Abstract

O desenvolvimento do RNA mensageiro (mRNA)-com base em terapêutica para o tratamento de várias doenças se torna cada vez mais importante devido o positivo Propriedades in vitro transcrito (IVT) mRNA. Com a ajuda de IVT mRNA, a síntese de novo de uma proteína desejada pode ser induzida sem alterar o estado fisiológico da célula alvo. Além disso, a biossíntese de proteínas pode ser controlada precisamente devido ao efeito transiente de mRNA IVT.

Para a eficiente transfecção de células, nanoliposomes (NLps) pode representar um veículo de entrega segura e eficiente para a terapêutica do mRNA. Este estudo descreve um protocolo para gerar segura e eficiente catiônica NLps consistindo de DC-colesterol e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga) como um vetor de entrega para IVT mRNA. NLps tendo um definido tamanho, uma distribuição homogénea e uma capacidade de complexação de alta e pode ser produzidos usando o método seco-filme. Além disso, apresentamos os sistemas de teste diferente para analisar sua complexação e eficácias de transfeccao usando sintética reforçada proteína verde fluorescente (eGFP) mRNA, bem como seus efeitos sobre a viabilidade celular. No geral, o protocolo apresentado fornece uma abordagem eficaz e segura para complexação de mRNA, que pode avançar e melhorar a administração de terapêutica mRNA.

Introduction

O uso de mRNA modificados para aplicações terapêuticas tem mostrado grande potencial no último par de anos. Em doenças cardiovasculares, inflamatórias e eurogenética, bem como no desenvolvimento de vacinas, o mRNA é um promissor agente terapêutico1.

Terapia de reposição de proteína com mRNA oferece diversas vantagens sobre a terapia de gene clássica, que se baseia a transfeccao de ADN em células alvo2. A função do mRNA inicia diretamente no citosol. Embora o plasmídeo de DNA (pDNA), uma construção de dupla-hélice, circular DNA contendo uma região promotora e uma sequência de genes codificação da proteína terapêutica3, também atos no citosol, pode apenas ser incorporado em células que estão passando por mitose no momento do transfection. Isso reduz o número de células transfectadas em tecido1,4. Especificamente, o transfeccao de tecidos com atividade fraca mitose, como as células cardíacas, é difícil5. Em contraste com pDNA, a transfeccao e tradução do mRNA ocorrem em células mitóticas e não-mitótica no tecido1,6. A integração viral do DNA no genoma do hospedeiro pode vir com efeitos mutagénicos ou reações imunes7,8, mas depois a transfecção de células com um mRNA de codificação de proteínas, a síntese de novo da proteína desejada começa-se autonomamente9,10. Além disso, a síntese de proteína pode ser ajustada precisamente a necessidade do paciente através de doses individuais, sem interferir com o genoma e arriscar efeitos mutagénicos11. O potencial imunológico-ativando de mRNA sinteticamente gerado poderia ser drasticamente reduzido usando pseudo uridina e 5′-methylcytidine em vez de uridina e citidina12. Uridina pseudo mRNA modificados também foi mostrado para ter uma maior estabilidade biológica e um significativamente maior capacidade translacional13.

Para poder beneficiar das propriedades promissoras de terapia baseada em mRNA em aplicações clínicas, é essencial para criar um veículo adequado para o transporte do mRNA para a célula. Este veículo deve suportar tóxicos propriedades in vitro e em vivo, proteger o mRNA contra nuclease-degradação e prever uma disponibilidade prolongada e tradução do mRNA14suficiente absorção celular.

Entre todos os tipos de portador possível para na vivo entrega da droga, como nanotubos de carbono, pontos quânticos e lipossomas, este último tem sido estudado a mais de15,16. Lipossomas são vesículas consistindo de bicamada lipídica10. Eles são anfifílica com uma hidrofóbica e uma parte hidrofílica, e através do auto arranjo destas moléculas, uma dupla camada esférica é formada de17. Dentro os lipossomas, agentes terapêuticos ou drogas podem ser encapsuladas e, assim, protegidas contra a degradação enzimática de18. Lipossomas contendo N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium cloreto (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimetilamonio) propano] (DOTAP)20e dioctadecylamidoglycylspermine (cães)21, ou DC-colesterol22, estão bem caracterizados e frequentemente utilizada para transfecção celular com DNA ou RNA.

Os lipossomas catiônicos compõem um lipido carregado positivamente e um fosfolipídeo descarregado23. Transfecção via catiônicos lipossomas é um dos métodos mais comuns para o transporte de ácidos nucleicos em células24,25. As partículas de lipídios catiônicos formam complexos com os grupos fosfato negativamente carregados na espinha dorsal de moléculas de ácido nucleico26. Estes chamados lipoplexes anexar à superfície da membrana celular e entrar na célula por endocitose ou mecanismos de endocitose-como27.

Em 1989, Malone et al. com êxito descrito mediada por lipídios catiônicos mRNA transfeccao28. No entanto, usando uma mistura de DOTMA e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga), o grupo encontrou que DOTMA manifestou efeitos citotóxicos28. Além disso, Zohra et al mostrou que DOTAP (cloreto de 1,2-dioleoyloxy-3-trimetilamónio-propano) pode ser usado como um de reagente de Transfeccao de mRNA29. No entanto, para a eficiente transfecção de células, DOTAP deve ser usado em combinação com outros reagentes, tais como fibronectina29 ou DOPE30. Até agora, DOTMA foi o primeiro lipídios catiônicos no mercado usado para o gene entrega31. Outros lipídios são utilizados como terapêuticas portadores ou estão a ser testados em diferentes fases de ensaios clínicos, (por exemplo, EndoTAG-eu, contendo DOTAP como um portador de lipídios), atualmente está sendo investigado em uma fase-II de julgamento clínico32.

Este trabalho descreve um protocolo para a geração de NLps contendo DC-colesterol e drogas. Esse método é fácil de executar e permite a geração de NLps de tamanhos diferentes. O objetivo geral de PNL geração usando o método seco-filme é criar lipossomas para complexação de mRNA, permitindo assim a célula eficiente e biocompatível transfecção em vitro14,33.

Protocol

1. geração de Nanoliposomes catiônica (Figura 1) Dissolva os lipídios DC-colesterol (3beta-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoil] colesterol cloridrato) e drogas (fosfatidiletanolamina dioleoyl), fornecido como um pó, em clorofórmio para obter uma concentração final de 25 mg/mL.Nota: Guarde os lipídios dissolvidos em-20 ° C. Trabalhar com 25 mg/mL de solução de ambos os lipídios. Mix de 40 µ l do DC-colesterol dissolvido e 80 µ l da droga dissolv…

Representative Results

Usando o protocolo como descrito, NLps consistindo de lipídeos DC-colesterol e droga foram preparadas usando o método seco-filme (Figura 1). Durante a preparação, a solução de nanoliposome mostra diferentes fases na turbidez (Figura 2). A eficácia de encapsulamento do NLps pode ser analisada após o encapsulamento de 1 µ g de mRNA eGFP-codificação, analisando …

Discussion

O protocolo apresentado descreve a geração de NLps com eficácia elevada de encapsulamento para mRNA sinteticamente modificado, assim como o transfection confiável de células em vitro. Além disso, os NLps garantir a liberação do mRNA, que por sua vez, é traduzida em uma proteína funcional no interior das células. Além disso, os transfections usando NLps podem ser executadas no meio celular regular, resultando em alta realidades da pilha durante a transfeccao, e durar até três dias depois do transfec…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nenhum

Materials

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) AppliChem, Darmstadt, Germany A2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) Avanti, Alabama, USA 700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany D1306
BD FACScan system BD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 340181
Chloroform Merck, Darmstadt, Germany 102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany 20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti, Alabama, USA 850725
Fluorescence microscope Zeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11668019
Mini extruder Avanti, Alabama, USA
Nuclease-free water Qiagen, Hilden, Germany 129114
Opti-Mem Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany Q33140
RPMI (w/o phenol red) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11835030
Silica gel Carl Roth, Karlsruhe, Germany P077
Trypsin/EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 25300054
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen, Hilden, Germany 202602
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Germany 28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		 TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1014
Cyanine 3-CTP PerkinElmer, Baesweiler, Germany NEL580001EA
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany AM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs, Ipswich, USA S1411L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Ipswich, USA M0289S
Agarose Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 16500-500
GelRed Biotium, Fremont, USA 41003
peqGOLD DNA ladder mix VWR, Pennsylvania, USA 25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder Fisher Scientific, Göteborg,
Sweden		 11528766
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Michel, T., Link, A., Abraham, M., Schlensak, C., Peter, K., Wendel, H., Wang, X., Krajewski, S. Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA. J. Vis. Exp. (144), e58444, doi:10.3791/58444 (2019).
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