JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Поколение катионного Nanoliposomes для эффективной доставки в Vitro транскрипции РНК

Published: February 01, 2019
doi:
10.3791/58444
, , , , , , ,
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory,University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology,Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine,Monash University

Summary

Здесь мы описываем протокол для поколения катионного nanoliposomes, который основан на методе сухой фильм и может использоваться для безопасного и эффективного предоставления в vitro транскрипции РНК.

Abstract

Разработка матричная РНК (мРНК)-на основе терапии для лечения различных заболеваний становится все более важным из-за положительные свойства в vitro трансляции мРНК (IVT). С помощью IVT мРНК de novo синтез желаемого белка может быть вызван без изменения физиологического состояния целевой ячейки. Кроме того Биосинтез белка может точно управляться из-за переходного эффекта ИВТ мРНК.

Для эффективного transfection клетки nanoliposomes (NLps) может представлять средство безопасной и эффективной доставки для терапевтических мРНК. Это исследование описывает протокол для создания безопасной и эффективной катионного NLps состоящий из DC-холестерина и 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ДОПИНГ) как вектор доставки для ИВТ мРНК. NLps, имеющие определенный размер, однородное распределение и высокая комплексообразованию потенциала и могут быть изготовлены с использованием метода сухой фильм. Кроме того, мы представляем различные тест-систем для анализа их комплексообразования и трансфекции узкоспециализированного с использованием синтетических расширение Зеленый флуоресцентный белок (eGFP) мРНК, а также их влияние на жизнеспособность клеток. В целом представленные протокол обеспечивает эффективный и безопасный подход мРНК комплексообразование, который может заранее и улучшить администрации терапевтических мРНК.

Introduction

Использование модифицированных мРНК для терапевтического применения показывает большой потенциал в последние пару лет. В моногенетическими, сердечно-сосудистой и воспалительных заболеваний, а также в разработке вакцин мРНК является перспективным терапевтический агент1.

Белка заместительной терапии с мРНК предлагает несколько преимуществ по сравнению с классической генная терапия, которая основана на ДНК трансфекции в целевой ячейки2. МРНК функция инициирует непосредственно в цитозоль. Хотя плазмидной ДНК (pDNA), конструкция двунитевая, циркуляр ДНК, содержащие промоутер региона и последовательности гена кодирования терапевтических белков-3, также акты в цитозоле, оно может только быть включены в клетки, которые проходят митоз в то время transfection. Это уменьшает количество transfected клеток в тканях1,4. В частности transfection тканей с слабой митоз активности, таких как сердечные клетки, является трудно5. В отличие от pDNA transfection и перевод мРНК происходят в митотическая и не митотическая клеток в ткани1,6. Вирусная интеграции ДНК в хост геномов может прийти с мутагенных эффектов или иммунных реакций7,8, но после transfection клетки с мРНК белка кодирования, de novo синтез белка желаемого начинает самостоятельно9,10. Кроме того синтез белков может быть скорректирована именно к потребности пациента путем индивидуальных доз, без вмешательства с геном и рискуя мутагенных эффектов11. Иммунной активации потенциал искусственно созданного мРНК может быть значительно снижен с помощью псевдо-уридина и 5′-methylcytidine вместо уридина и Цитидин12. Псевдо-уридина модифицированных мРНК также было показано повышение биологической стабильности и значительно выше трансляционная потенциала13.

Чтобы иметь возможность воспользоваться перспективных свойств на основе мРНК терапии в клинических приложений, важно создать подходящее транспортное средство для перевозки мРНК в клетку. Этот автомобиль должен нести нетоксичные свойства в пробирке и в естественных условиях, защитить против нуклеиназы деградации мРНК и обеспечивают достаточно клеточного поглощения для длительного доступности и перевод мРНК14.

Среди всех типов возможных перевозчика в естественных условиях доставки наркотиков, например, углеродных нанотрубок, квантовые точки и липосомы, последние были изучены наиболее15,16. Липосомы являются везикулы, состоящий из липидного бислоя10. Они амфифильных с гидрофобных и гидрофильных секции, и через самостоятельной расположение этих молекул, сферические двойной слой является форматом17. Внутри липосомы терапевтических агентов или наркотиков можно инкапсулировать и, таким образом, защищен от18энзимной деградации. Липосомы, содержащие N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium хлорид (DOTMA)19, [1,2-бис (oleoyloxy) -3-пропан (trimethylammonio)] (DOTAP)20и21dioctadecylamidoglycylspermine (собаки), или DC-холестерин22, хорошо характеризуется и часто используется для сотовых трансфекции с ДНК или РНК.

Катионный липосомы составляют положительно заряженных липидов и незаряженных фосфолипидного23. Трансфекция через Катионный липосомы является одним из наиболее распространенных методов для перевозки нуклеиновых кислот в клетки24,25. Катионоактивный липид частицы образуют комплексы с отрицательно заряженных фосфатными группами в основу нуклеиновых кислот молекул26. Эти так называемые lipoplexes придают поверхности клеточной мембраны и войти в камеру через эндоцитоз или эндоцитоза как механизмы27.

В 1989 году Мэлоун и др. успешно описал катионоактивный липид опосредованной мРНК трансфекции28. Однако используя смесь DOTMA и 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ДОПИНГ), Группа обнаружила, что DOTMA проявляется цитотоксических эффектов28. Кроме того Зохра et al. показал, что DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-триметиламмония пропан хлорид) может использоваться как реагент мРНК в трансфекции29. Однако для эффективного transfection клетки, DOTAP должен использоваться в сочетании с другими реагенты, такие как фибронектин29 или30ДОПИНГ. Пока DOTMA был первым Катионный липидов на рынке, используемых для доставки генов31. Другие липиды используются как терапевтические перевозчиков или тестируются на разных стадиях клинических испытаний, (например, EndoTAG-I, содержащее DOTAP как перевозчик липидов), в настоящее время изучается в фазы II клинических судебного32.

Эта работа описывает протокол для поколения NLps, содержащих DC-холестерин и ДОПИНГ. Этот метод легко выполнить и позволяет генерировать NLps разных размеров. Общая цель НЛП поколения, с помощью метода сухой фильм является создание липосом для комплексообразованию мРНК, таким образом позволяя transfection клеток эффективным и биосовместимых в vitro14,33.

Protocol

1. поколение катионного Nanoliposomes (рис. 1) Растворите липиды DC-холестерина (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] холестерина гидрохлорид) и ДОПИНГ (dioleoyl фосфатидилэтаноламина), поставляется в виде порошка, в хлороформе для достижения конечной концентрации 25 мг/мл.Примечание: Х…

Representative Results

Используя протокол как описано, NLps, состоящий из липидов, DC-холестерин и ДОПИНГ были подготовлены с использованием метода сухой фильм (рис. 1). В ходе подготовки nanoliposome решение показывает различные этапы в мутность (рис. 2). <p class="jove_content" f…

Discussion

Представленные протокол описывает поколения NLps с высоким инкапсуляции эффективность для искусственно модифицированных мРНК, а также надежных transfection клетки в пробирке. Кроме того NLps гарантируют освобождение мРНК, который в свою очередь, будет переведен на функциональных белков в…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Нет

Materials

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) AppliChem, Darmstadt, Germany A2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) Avanti, Alabama, USA 700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany D1306
BD FACScan system BD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 340181
Chloroform Merck, Darmstadt, Germany 102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany 20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti, Alabama, USA 850725
Fluorescence microscope Zeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11668019
Mini extruder Avanti, Alabama, USA
Nuclease-free water Qiagen, Hilden, Germany 129114
Opti-Mem Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany Q33140
RPMI (w/o phenol red) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11835030
Silica gel Carl Roth, Karlsruhe, Germany P077
Trypsin/EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 25300054
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen, Hilden, Germany 202602
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Germany 28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		 TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1014
Cyanine 3-CTP PerkinElmer, Baesweiler, Germany NEL580001EA
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany AM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs, Ipswich, USA S1411L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Ipswich, USA M0289S
Agarose Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 16500-500
GelRed Biotium, Fremont, USA 41003
peqGOLD DNA ladder mix VWR, Pennsylvania, USA 25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder Fisher Scientific, Göteborg,
Sweden		 11528766
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics–developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
  2. Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
  3. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  4. Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don’t shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
  5. Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
  6. Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
  7. Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
  8. Youn, H., Chung, J. -. K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
  9. Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8 (2014).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
  11. Michel, T., Wendel, H. -. P., Krajewski, S., Kormann, M. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. , 3-20 (2016).
  12. Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  13. Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
  14. Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
  15. Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
  16. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  17. Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
  18. Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
  19. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  20. Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
  21. Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
  22. Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
  23. Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
  24. Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
  25. Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
  26. Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
  27. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
  28. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
  29. Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
  30. Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
  31. Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497 (2011).
  32. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  33. Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
  34. Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943 (2014).
  35. Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
  36. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
  37. Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
  38. Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
  39. Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
  40. Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
  41. Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
  42. Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
  43. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience Reports. 22 (2), 197-224 (2002).
  44. Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. “In vivo” distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
  45. Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
  46. Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
  47. Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
  48. Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
  49. Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
  50. Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
  51. Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
  52. Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
  53. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
  54. Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
  55. Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
  56. Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
  57. Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
  58. Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504 (2015).
  59. Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
  60. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).

Tags

Cationic NanoliposomesMRNA DeliveryTransfectionNanoparticleLipid FilmExtrusionNanolipoplexA549 Cells
check_url/58444?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Michel, T., Link, A., Abraham, M., Schlensak, C., Peter, K., Wendel, H., Wang, X., Krajewski, S. Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA. J. Vis. Exp. (144), e58444, doi:10.3791/58444 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image