توجيه نسب إعادة برمجة الماوس الكبار تنتجها الخلايا الليفية لموروث محمر
Summary
هنا نقدم لدينا بروتوكول لإنتاج فعل المباشر المتكفل محمر (المقدمة) من الماوس الليفية الكبار استخدام النسخ التي يحركها عامل النسب إعادة برمجة (DLR).
Abstract
الالتزام خلية محمر والتمايز المضي قدما من خلال تفعيل شبكة النسخي مقيدة بالنسب مدبرة من قبل مجموعة من مصير الخلية تحديد ونضج العوامل. ونحن المبينة سابقا لتحديد الحد الأدنى لعدد من العوامل اللازمة لإرشاد وتطوير خلايا الدم الحمراء باستخدام النسب المباشر إعادة برمجة الخلايا الليفية في محمر المستحث المتكفل/السلائف (المقدمة). لقد أظهرنا أن overexpression من Gata1، Tal1، Lmo2، و جيم-حركة (جتلم) يمكن سرعة تحويل موريني والبشرية الليفية مباشرة إلى المقدمة التي تشبه الخلايا محمر حسن النية من حيث التشكل، النمط الظاهري، والتعبير الجيني. ونحن نعتزم أن المقدمة ستوفر أداة لا تقدر بثمن لدراسة اللائحة مصير تكون الكريات الحمر والخلية. هنا يصف لنا عملية تدريجية لتحويل ذيل موريني نصيحة الليفية في المقدمة عن طريق النسخ يحركها عامل مباشرة نسب إعادة برمجة (DLR). في هذا المثال، نقوم بإعادة برمجة في الخلايا الليفية من الفئران محمر تتبع النسب التي تعبر عن البروتين نيون أصفر (يفب) تحت سيطرة المروج الجينات (ابور) مستقبلات ارثروبويتين، تمكين التصور خلية محمر مصير الحث على إعادة برمجة. وفي أعقاب هذا البروتوكول، يمكن أن تعاد برمجتها الليفية في المقدمة في غضون خمسة إلى ثمانية أيام.
بينما لا يزال يمكن إدخال تحسينات على العملية، ونحن تبين أن جتلم بوساطة إعادة برمجة عملية سريعة ومباشرة، مما أسفر عن الخلايا التي تحتوي على خصائص من حسن النية الخلايا السلف والسلائف محمر.
Introduction
خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) ضرورية في جميع الفقاريات ويشكلون نسبة 84 في المائة من كافة الخلايا من الهيئات البشرية1. من الجنينية إلى حياة الكبار، صحتنا تعتمد اعتماداً كبيرا على التنظيم الدقيق للتوازن ربك. من المعروف استمرار الإنتاج لكرات الدم الحمراء الناضجة في جميع أنحاء التنمية في مرحلة البلوغ تكون الكريات الحمر. تحديا رئيسيا في تكون الكريات الحمر للبحث هو تحديد الجهات التنظيمية الرئيسية التي تنسق التنمية ربك والتبديل بين البدائية ونهائية تكون الكريات الحمر. النسب المباشر إعادة برمجة المتكفل محمر فرصة لزيادة فهم التنمية محمر في فيفو.
النسب المباشر برمجة (DLR)، المعروفة أيضا باسم ترانسديفيرينتييشن، هو عملية إعادة برمجة واحدة من نوع الخلية مباشرة إلى آخر، تجاوز pluripotent ومراحل السلف مولتيبوتينت. وقد استخدمت حتى الآن DLR لإنتاج العديد من أنواع الخلايا بما في ذلك العصبية2و المكونة للدم3،،من45، والكبد6 والكلوية7، خلايا السلف. لعلماء الأحياء التنموي، أصبح DLR أداة هامة لاستجواب جوانب الالتزام بالنسب والتمايز المحطة الطرفية عمليات8،9. يمكن تكمل DLR واستبدال جزئيا في فيفو دراسات لفهم آليات لمصير الخلية العوامل المحددة أثناء التطوير. وينص البروتوكول DLR لإعادة برمجة لموروث محمر المبينة في هذه الورقة الحقل طريقة مجانية للدراسات التنموية لتكون الكريات الحمر.
وقد أثبتنا سابقا أن overexpression كوكتيل أربعة معامل، GATA1، TAL1، LMO2، و ج-حركة (جتلم)، كافية لإعادة برمجة الليفية مورين والبشرية على السواء مباشرة إلى فروعه محمر المستحث (المقدمة) 10-الخلايا محمر “جتلم” برمجة يشابه إلى حد كبير حسن النية محمر البدائية موروث من حيث التعبير مورفولوجيا والنمط الظاهري والجيني10. وهكذا المقدمة قد حدت من قدرة الانتشار وناضجة للكريات الحمراء المنواه مماثلة لتلك التي تنتجها عابر في الجنين المبكر قبل بداية نهائي تكون الكريات الحمر. عن طريق إجراء تغييرات في شروط إعادة برمجة (مثل الطفرات في إعادة برمجة العوامل أو إضافة عوامل أخرى)، يمكننا أن نفهم كيف يؤدي ذلك إلى تغييرات في التنمية محمر والتمايز. ونحن على سبيل المثال أظهرت أن Klf1 أو Myb بالإضافة إلى كوكتيل جتلم تغيير نمط التعبير جلوبين من الدرجة الأولى الجنينية (البدائية) للكبار أساسا (نهائي). وهذا الاستنتاج يؤكد صلاحية استخدام DLR كأداة لتحديد العوامل التنموية في تكون الكريات الحمر.
هنا، فإننا مخطط عملية توليد المقدمة من ذيل الماوس نصيحة الليفية (الصناديق الاستئمانية). في نتائج تمثيلية، أجرينا إعادة برمجة في الخلايا الليفية من الفئران تتبع النسب محمر (ابور-لجنة المساواة العرقية R26-ايفب) الذي يعرب عن البروتين نيون أصفر (ايفب) من محور Rosa26 في جميع الخلايا التي أعرب عن مستقبلات ارثروبويتين، السماح للتصور من السهل الالتزام بنسب محمر. باستخدام هذا الأسلوب، يفب الإيجابية (+ ابور) خلايا موجودة لها في أقرب وقت بعد توصيل خمسة أيام. ويوفر هذا البروتوكول، ولذلك، تقنية سريعة وقوية لتوليد محمر فروعه في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
Overexpression كوكتيل أربعة معامل، GATA1، TAL1، LMO2، و ج-حركة (جتلم)، غير كافية لإعادة برمجة الخلايا الليفية مورين والبشرية مباشرة إلى المقدمة10. الخلايا محمر أعيدت برمجتها تشبه إلى حد كبير حسن النية محمر موروث من حيث مورفولوجي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر وانغ إيفلين وهايد غريغوري (معهد وايتهيد، كامبريدج، ماجستير) للاستنساخ وهارفي لوديش (معهد وايتهيد) لتوفير العديد من البلازميدات المستخدمة لإنشاء مكتبة للفيروسات الرجعية. ونحن نشكر مجاهد سيفا وصوفي سينجبرانت (قسم الطب الجزيئي والعلاج الجيني، وجامعة لوند) وكارلسون غوران سونيجي شامية (قسم أمراض الدم الجزيئية، جامعة لوند) لأدوارها في وصف لإنتاج iEP. ونود أيضا تقر وأن تشكر بوليسيو جوليان (مركز الطب التجديدي، ومجمع البحوث الطبية الحيوية برشلونة)، فيوليتا رايون-استرادا (روكفلر جامعة نيويورك)، وكارل والكليي (معهد “البحوث الطبية في” سانت فنسنت و قسم للطب، مستشفى سانت فنسنت، جامعة ملبورن)، أنخل الراية (المؤسسة الكتلانية للبحوث والدراسات المتقدمة، برشلونة)، وفيجاي غ. سانكاران (معهد واسع من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وجامعة هارفارد، كمبردج ) لمساهماتها السابقة في هذا العمل. هذا العمل كان يدعمها راغنار سودربيرغ المؤسسة (J.F.)؛ البحوث السويدية مجلس (J.F.)؛ هيروكي ستيفتيلسين انجكفيست Byggmästare (إلى J.F.)؛ المؤسسة السويدية للبحوث الاستراتيجية (ل J.F.)؛ المؤسسة أك ويبيرج (J.F.)؛ ماري كوري تكامل منحة (J.F.).
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
