리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접
Summary
생산 유발에 대 한 우리의 프로토콜 여기 제시 erythroid 창시자 (Iep) 성인 섬유 아 세포 전사 인자 제어를 사용 하 여 마우스에서에서 직접 혈통 프로그래밍 (DLR).
Abstract
Erythroid 셀 헌신 및 분화 세포 운명 결정 및 성숙 요인의 그룹에 의해 조율 된 혈통 제한 transcriptional 네트워크의 활성화를 통해 진행 됩니다. 우리는 직접 혈통 유도 erythroid 창시자/선구자 (Iep)으로 섬유 아 세포의 프로그래밍을 사용 하 여 적혈구 개발 지시에 필요한 요인의 최소 집합을 정의 하려면 이전 밖으로 설정. 우리 보여 그 overexpression Gata1의 Tal1, Lmo2및 c-Myc (GTLM) 수 변환 murine와 인간의 섬유 아 세포 직접 Iep 유사한 형태학, 측면에서 보 나 fide erythroid 셀을 빠르게 표현 형, 그리고 유전자 발현입니다. 우리는 Iep 적혈구와 세포 운명 조절 연구에 귀중 한 도구를 제공할 것입니다 것입니다. 여기는 Iep 통해 전사 요소 기반 직접 혈통 (DLR) 프로그래밍 murine 꼬리 팁 fibroblasts 변환의 단계적 과정에 설명 합니다. 이 예제에서 erythroid 셀의 시각화 수 있도록 리스로 수용 체 유전자 (EpoR) 발기인의 통제 노란 형광 성 단백질 (YFP)을 나타내는 erythroid 계보 추적 마우스에서 fibroblasts에 프로그래밍 수행 프로그래밍에 따라 운명 감 응 작용입니다. 이 프로토콜에 따라 5 ~ 8 일 이내 fibroblasts Iep에 재설정 수 있습니다.
개선 과정에 아직도 할 수 있다, 우리 표시 프로그래밍 GTLM 중재 하는 것이 신속 하 고 직접적인 프로세스는 저조한 진실 fide 의 속성을 가진 셀 erythroid 조상 및 선구자 세포.
Introduction
적혈구 (Rbc)는 모든 척추 동물에 필수적인 고 인체1의 모든 셀의 84%. 성인 생활에 배아에서 우리의 건강 높은 RBC 항상성의 정확한 규칙에 따라 달라 집니다. 성인으로 개발에 걸쳐 성숙한 RBCs의 지속적인 생산 적혈구로 알려져 있다. 적혈구 연구의 주요 과제 RBC 개발 및 원시적이 고 확실 한 적혈구 사이 스위치 조정 마스터 레 귤 레이 터를 정의 하는 것입니다. 직접 혈통 erythroid 창시자의 프로그래밍 erythroid 개발 비보를 더욱 이해 하는 기회를 선물 한다.
직접 혈통 프로그래밍 (DLR), transdifferentiation, 일컬어 프로그래밍 한 셀 형식을 직접으로, 만능 multipotent 조상 단계를 우회 하는 프로세스입니다. DLR은 지금까지 신경2조 혈3,,45, 간장6 , 신7, 조상 세포를 포함 하 여 수많은 셀 유형을 일으킬 사용 되었습니다. 발달 생물학에 대 한 DLR 혈통 헌신과 터미널 차별화 프로세스8,9의 질의 측면에 대 한 중요 한 도구가 되고있다. DLR 보완 하 고 vivo에서 연구 개발 하는 동안 요소를 결정 하는 세포 운명의 이해 메커니즘에 대 한 부분적으로 대체할 수 있습니다. 이 문서에서 설명 하는 erythroid 창시자에 프로그래밍에 대 한 DLR 프로토콜 필드에 게 적혈구의 개발 연구에 대 한 무료 방법의 제공 한다.
우리는 이전 4-팩터 칵테일의 overexpression, GATA1, TAL1, LMO2, 및 c-MYC (GTLM), erythroid 유도 창시자에 직접 murine와 인간의 섬유 아 세포를 재 설 정할 충분 한지 증명 하고있다 (Iep) 10. erythroid는 GTLM 재설정 셀 크게 닮은 형태, 표현 형, 그리고 유전자 식10면에서 보 나 타고 난 기본 erythroid 창시자. 따라서 Iep 확산 수 용량을 제한 하 고 뚜렷이 확실 한 적혈구의 발병 하기 전에 초기 배아에서 생산 된 것과 유사한 nucleated 적혈구 성숙. 재활 조건 (예를 들어, 요소 또는 다른 요소의 추가 프로그래밍에서 점 돌연변이)에서 변경 하 여, 하나는이 erythroid 개발 및 차별화에 변화를 리드 하는 방법을 이해할 수 있다. 우리는 예를 표시 GTLM 칵테일에 Klf1 또는 Myb 의 추가 주로 배아 (기본)에서 globin 식 패턴 변경 주로 성인 (최종). 이 이는 적혈구에 발달 요소를 정의 하기 위한 도구로 DLR을 사용 하 여 유효성을 뒷받침.
여기, 우리 iEPs를 마우스 꼬리 팁 섬유 아 세포 (TTF)에서 생성 하는 과정을 설명 합니다. 우리의 대표 결과에 우리 erythroid 리니지 추적 마우스에서 fibroblasts에 프로그래밍을 수행 (Epor-Cre R26-eYFP) 세포는 모든 Rosa26 소재 시에서 노란 형광 성 단백질 (eYFP)를 표현 erythroid 계보에 헌신의 쉽게 시각화 수 있도록 리스로 수용 체를 표현 했다. 이 메서드를 사용 하 여 셀 (EpoR +) YFP 긍정적인 존재 하는 변환 후 5 일입니다. 이 프로토콜을 따라서, erythroid 창시자에서 생체 외에서의 세대에 대 한 신속 하 고 강력한 기술을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
4 단계 칵테일의 overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 및 c-MYC (GTLM), Iep10에 직접 murine와 인간의 섬유 아 세포를 재 설 정할 충분 하다. 재설정된 erythroid 세포는 크게 진실 fide erythroid 창시자를 형태, 표현 형, 유전자 발현, 그리고 식민지를 형성 하는 능력을 닮았다. 이 조에 발달 요소를 정의 하기 위한 도구?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 감사에 블 린 왕와 그레고리 하이드 (화이트 헤드 연구소, 케임브리지, MA) 복제와 하 비 Lodish (화이트 헤드 연구소)에 대 한 많은 retroviral 라이브러리를 생성 하는 데 사용 하는 플라스 미드의 제공. 우리 iEP 생산의 설명에서 그들의 역할에 대 한 더 Siva와 소피 Singbrant (학과 분자 의학 및 유전자 치료, 룬 드 대학), 예란 Karlsson Shamit Soneji (학과 분자 혈액학, 룬 드 대학) 감사합니다. 우리 또한 인정 하 고 율리우스 Pulecio (재생 의학 센터, 바르셀로나 메디컬 리서치 파크), 비 올레 타 레이 온 스 트 라 다 (록펠러 대학교, 뉴욕), 칼 Walkley 감사 하 고 싶습니다 (세인트 빈센트의 연구소의 의학 연구와 학과 의학, 세인트 빈센트 병원, 멜버른 대학), 앙 헬 라 야 (연구 및 첨단된 연구, 바르셀로나에 대 한 카탈로니아어 기관), 그리고 비제이 G. Sankaran (광범위 한 기술 및 하버드, 캠브리지, 매사 추세 츠 연구소의 연구원 )이이 작품에 그들의 이전 기여 금을 위해. 이 작품 (J.F.);에 라 그 나 Söderberg 재단에 의해 지원 되었다 스웨덴 연구 위원회 (J.F.);에 Stiftelsen 올레 Engkvist Byggmästare (J.F.);에 전략적 연구 (J.F.);에 대 한 스웨덴 재단 (J.F.);를 아 Wiberg의 기초 (J.F.)에 마리 퀴리 통합 그랜트.
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
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