Direkte afstamning omprogrammering af voksne mus Fibroblast til Erythroid ophav
Summary
Her præsenterer vi vores protokol for producerer induceret erythroid ophav (iEPs) fra mus voksen fibroblaster transskription faktor-drevet direkte afstamning omprogrammering (DLR).
Abstract
Erythroid celle engagement og differentiering fortsætte gennem aktivering af en slægt-begrænset transcriptional netværk orkestreret af en gruppe af celle skæbne bestemmelse og modning faktorer. Vi tidligere fastsat til at definere den minimalt sæt af nødvendige for instruere rød blod celle udvikling ved hjælp af direkte afstamning omprogrammering af fibroblaster til induceret erythroid progenitorceller/prækursorer (iEPs) faktorer. Vi viste at overekspression af Gata1, Tal1, Lmo2og c-Myc (GTLM) kan hurtigt konvertere murine og humane fibroblaster direkte til iEPs, der ligner Bonafide erythroid celler i morfologi, fænotype, og genekspression. Vi har til hensigt at iEPs vil give et uvurderligt værktøj for at studere erythropoiesen og celle skæbne forordning. Her beskriver vi de trinvis proces med at konvertere murine Hale spids fibroblaster til iEPs via transskription faktor-drevet direkte afstamning omprogrammering (DLR). I dette eksempel udføre vi omprogrammering i fibroblaster fra erythroid afstamning sporingen mus, der udtrykker den gul fluorescerende proteiner (YFP) under kontrol af erythropoietin receptor genet (EpoR) promotor, gør det muligt for visualisering af erythroid celle skæbne induktion ved omprogrammering. Efter denne protokol, kan fibroblaster omprogrammeres til iEPs inden for fem til otte dage.
Mens kan stadig forbedres til processen, viser vi, at GTLM-medieret omprogrammering er en hurtig og direkte proces, giver celler med egenskaberne for Bonafide erythroid Stamform og forløber celler.
Introduction
Røde blodlegemer (RBC) er afgørende i alle hvirveldyr og udgør 84% af alle celler af menneskelige organer1. Fra embryonale til voksne liv er vores sundhed meget afhængig af præcis regulering af RBC homøostase. Den løbende produktion af modne røde blodlegemer i hele udvikling ind i voksenalderen er kendt som erythropoiesen. En stor udfordring i erythropoiesen forskning er at definere de master regulatorer, der dirigerer RBC udvikling og skifte mellem primitive og endelige erythropoiesen. Direkte afstamning omprogrammering af erythroid progenitorceller præsenterer en lejlighed til yderligere at forstå erythroid udvikling in vivo.
Direkte afstamning omprogrammering (DLR), også kendt som transdifferentiation, er processen med omprogrammering én celletype direkte ind i en anden, omgåelse pluripotente og Multipotente stamceller faser. DLR er hidtil blevet brugt til at producere mange celletyper, herunder neurale2, hæmatopoietisk3,4,5, hepatisk6 og nefrotisk7, stamceller. For udviklingsmæssige biologer, er DLR blevet et vigtigt redskab for afhører aspekter af afstamning engagement og terminal differentiering processer8,9. DLR kan supplere og delvist erstatte i vivo undersøgelser for forståelse mekanismer af celle skæbne afgørende faktorer under udviklingen. DLR protokol for omprogrammering til erythroid progenitorceller beskrevet i denne hvidbog indeholder feltet en gratis metode til udviklingsmæssige undersøgelser af erythropoiesen.
Vi har tidligere vist, at overekspression af en fire-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, og c-MYC (GTLM), er tilstrækkelige til at omprogrammere murine og humane fibroblaster direkte til induceret erythroid ophav (iEPs) 10. the GTLM omprogrammerede erythroid celler meget ligner Bonafide primitive erythroid ophav i form af morfologi og fænotype gen expression10. Dermed iEPs har begrænset spredning kapacitet og moden til nukleeret erytrocytter svarende til dem, der forbigående produceres i den tidlige embryon før starten af endelige erythropoiesen. Ved at foretage ændringer i de omprogrammering betingelser (fx punktmutationer i omprogrammering faktorer eller tilsætning af andre faktorer), kan man forstå, hvordan dette fører til ændringer i erythroid udvikling og differentiering. Vi har for eksempel vist at tilføjelsen af Klf1 eller Myb til GTLM cocktail ændrer globin udtryk mønster fra overvejende embryonale (primitiv) til fortrinsvis voksne (endelige). Dette resultat bekræfter gyldigheden af ved hjælp af DLR som et redskab til at definere udviklingsmæssige faktorer i erythropoiesen.
Her, skitsere vi processen til oprettelse af iEPs fra mus Hale spids fibroblaster (TTF). I vores repræsentative resultater, vi udførte omprogrammering på fibroblaster fra erythroid afstamning sporingen mus (Epor– Cre R26– eYFP) som express gul fluorescerende proteiner (eYFP) fra Rosa26 locus i alle celler, har udtrykt erythropoietin receptor, giver mulighed for nem visualisering af engagement i erythroid slægt. Du bruger denne metode, er YFP positive (EpoR +) celler til stede så tidligt som i fem dage efter transduktion. Denne protokol tilbyder derfor en hurtig og robust teknik for generation af erythroid ophav i vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Overekspression af en fire-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, og c-MYC (GTLM), er tilstrækkelige til at omprogrammere murine og humane fibroblaster direkte til iEPs10. Omprogrammerede erythroid celler meget lignede Bonafide erythroid progenitorceller morfologi, fænotype, genekspression og kolonidannende evne. Dette resultat bekræfter rationale for at bruge direkte omprogrammering s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takke Evelyn Wang og Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) til kloning og Harvey Lodish (Whitehead Institute) for at give mange af de plasmider, bruges til at generere retroviral biblioteket. Vi takke Benny Siva og Sofie Singbrant (Institut for Molekylær medicin og Gene Therapy, Lunds Universitet), Göran Karlsson og Shamit Soneji (Institut for Molekylær hæmatologi, Lunds Universitet) for deres roller i beskrivelse af iEP produktion. Vi vil også gerne anerkende og takke Julian Pulecio (Center for regenerativ medicin, Barcelona biomedicinsk forskning Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent’s Institut for medicinalforskning og Institut for medicin, St. Vincent’s Hospital, University of Melbourne), Ángel Raya (catalansk Institution for forskning og videregående studier, Barcelona), og Jesper G. Ina (Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology og Harvard, Cambridge ) for deres tidligere bidrag til dette arbejde. Dette arbejde blev støttet af Ragnar Söderberg Foundation (til J.F.); Svenske forskning Rådet (til J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (til J.F.); den svenske Foundation for strategisk forskning (til J.F.); Åke Wiberg Foundation (til J.F.); Marie Curie integration tilskud (til J.F.).
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
