वयस्क माउस के प्रत्यक्ष वंश reprogramminging Fibroblast करने के लिए Erythroid Progenitors
Summary
यहां हम माउस से प्रेरित erythroid progenitors उत्पादन के लिए हमारे प्रोटोकॉल वर्तमान वयस्क प्रतिलेखन कारक का उपयोग fibroblasts प्रत्यक्ष वंश reprogramminging (डीएलआर) चालित ।
Abstract
Erythroid सेल प्रतिबद्धता और भेदभाव एक वंश के सक्रियकरण के माध्यम से आगे बढ़ना प्रतिबंधित transcriptional नेटवर्क सेल भाग्य का निर्धारण और परिपक्व कारकों के एक समूह द्वारा किया । हम पहले से बाहर सेट करने के लिए लाल रक्त कोशिका fibroblasts प्रेरित erythroid progenitors/पुरोगामी (iEPs) में प्रत्यक्ष वंश reprogramminging का उपयोग कर विकास के निर्देश के लिए आवश्यक कारकों की ंयूनतम सेट परिभाषित । हमें पता चला है कि Gata1, Tal1, Lmo2, और सी Myc (GTLM) के व्यक्त तेजी से murine और मानव fibroblasts सीधे iEPs कि आकृति विज्ञान, बोना के मामले में erythroidी phenotype कोशिकाओं के समान में परिवर्तित कर सकते हैं, और जीन अभिव्यक्ति । हमारा इरादा है कि iEPs erythropoiesis और सेल भाग्य विनियमन अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करेगा । यहां हम प्रतिलेखन कारक के माध्यम से iEPs में murine पूंछ टिप fibroblasts परिवर्तित करने की stepwise प्रक्रिया का वर्णन प्रत्यक्ष वंश reprogramminging (डीएलआर) संचालित । इस उदाहरण में, हम erythroid वंश से fibroblasts में reprogramminging-चूहों कि व्यक्त erythropoietin रिसेप्टर जीन (EpoR) प्रमोटर के नियंत्रण में पीली फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) एक्सप्रेस, erythroid सेल के दृश्य को सक्षम करने के प्रदर्शन reprogramminging पर भाग्य प्रेरण । इस प्रोटोकॉल के बाद, fibroblasts को पांच से आठ दिनों के भीतर iEPs में पुनर्कार्यक्रम किया जा सकता है ।
हालांकि सुधार अभी भी इस प्रक्रिया के लिए किया जा सकता है, हम बताते है कि GTLM मध्यस्थता reprogramminging एक तेजी से और प्रत्यक्ष प्रक्रिया है, बोना के गुणों के साथ कोशिकाओं उपज erythroid जनक और प्रणेता कोशिकाओं ।
Introduction
लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) सभी रीढ़ में आवश्यक है और मानव शरीर के सभी कोशिकाओं के ८४% अप करना1। भ्रूण से वयस्क जीवन के लिए, हमारे स्वास्थ्य आरबीसी homeostasis के सटीक विनियमन पर अत्यधिक निर्भर है । वयस्कता में विकास के दौरान परिपक्व RBCs के चल रहे उत्पादन erythropoiesis के रूप में जाना जाता है । erythropoiesis अनुसंधान में एक प्रमुख चुनौती है मास्टर नियामकों कि आरबीसी विकास आर्केस्ट्रा और आदिम और निश्चित erythropoiesis के बीच स्विच को परिभाषित है । erythroid progenitors के प्रत्यक्ष वंश reprogramminging vivo मेंआगे erythroid विकास को समझने के लिए एक अवसर प्रस्तुत करता है ।
प्रत्यक्ष वंश reprogramminging (डीएलआर), भी transdifferentiation के रूप में जाना जाता है, एक दूसरे में सीधे एक सेल प्रकार reprogramminging की प्रक्रिया है, pluripotent और multipotent जनक चरणों को दरकिनार । डीएलआर इस प्रकार अब तक तंत्रिका2, टेम3,4,5, यकृत6 और नेफ्रोटिक7, जनक कोशिकाओं सहित कई कोशिका प्रकार के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया है । विकास जीव के लिए, डीएलआर वंश प्रतिबद्धता और टर्मिनल भेदभाव के पहलुओं से पूछताछ के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है8,9प्रक्रियाओं । डीएलआर पूरक और आंशिक रूप से सेल भाग्य के तंत्र विकास के दौरान कारकों का निर्धारण समझने के लिए vivo अध्ययन में बदल सकते हैं । इस पत्र में वर्णित erythroid progenitors को reprogramminging के लिए डीएलआर प्रोटोकॉल क्षेत्र erythropoiesis के विकास के अध्ययन के लिए एक मानार्थ विधि प्रदान करता है ।
हम पहले से प्रदर्शन किया है कि एक चार कारक कॉकटेल, GATA1, TAL1, LMO2, और सी-MYC (GTLM)के व्यक्त, दोनों murine और मानव fibroblasts को सीधे reprogram erythroid progenitors के लिए पर्याप्त है (iEPs) 10. GTLM-reprogramme कोशिकाओं बहुत सदृश बोना के रूप में erythroid progenitors, phenotype, और जीन अभिव्यक्ति10के मामले में । इस प्रकार iEPs प्रसार क्षमता और nucleated एरिथ्रोसाइट्स क्षणिक निश्चित erythropoiesis की शुरुआत से पहले जल्दी भ्रूण में उत्पादित उन लोगों के लिए समान परिपक्व है । reprogramminging शर्तों (जैसे, reprogramminging कारकों या अंय कारकों के अलावा में अंक उत्परिवर्तनों) में परिवर्तन करने से, एक समझ सकते है कि यह कैसे erythroid विकास और भेदभाव में परिवर्तन होता है । हम उदाहरण के लिए दिखाया गया है कि Klf1 या Myb GTLM कॉकटेल के अलावा मुख्य रूप से भ्रूण (आदिम) से ग्लोबिन अभिव्यक्ति पैटर्न में परिवर्तन मुख्यतः वयस्क (निश्चित) । इस खोज corroborates erythropoiesis में विकास कारकों को परिभाषित करने के लिए एक उपकरण के रूप में डीएलआर का उपयोग करने की वैधता ।
यहां, हम माउस पूंछ टिप fibroblasts (TTF) से iEPs पैदा करने की प्रक्रिया रूपरेखा । हमारे प्रतिनिधि परिणामों में, हम erythroid वंश से fibroblasts पर reprogramminging-चूहों अनुरेखण (Epor-Cre R26-eYFP) जो सभी कोशिकाओं में eYFP Rosa26 से पीली फ्लोरोसेंट प्रोटीन (लोकस) एक्सप्रेस प्रदर्शन किया है कि erythropoietin रिसेप्टर व्यक्त किया है, erythroid वंश के लिए प्रतिबद्धता के आसान दृश्य की अनुमति । इस विधि का उपयोग करते हुए, YFP धनात्मक (EpoR +) कक्ष transduction के बाद पांच दिन के रूप में जल्दी उपस्थित होते हैं । इस प्रोटोकॉल, इसलिए, इन विट्रो मेंerythroid progenitors की पीढ़ी के लिए एक त्वरित और मजबूत तकनीक प्रदान करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक चार कारक कॉकटेल, GATA1, TAL1, LMO2, और सी-MYC (GTLM)के व्यक्त करने के लिए पर्याप्त murine fibroblasts और मानव iEPs करने के लिए सीधे है10। reprogrammeed erythroid कोशिकाओं बहुत आकृति विज्ञान, phenotype, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एवलिन वांग और ग्रेगरी हाइड (व्हाइटहेड संस्थान, कैंब्रिज, एमए) क्लोनिंग और हार्वे Lodish के लिए धंयवाद (व्हाइटहेड संस्थान) retroviral पुस्तकालय पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया plasmids के कई प्रदान करने के लिए । हम Kavitha शिव और Sofie Singbrant (आणविक चिकित्सा और जीन चिकित्सा विभाग, Lund विश्वविद्यालय), Göran कार्लस्सन और श्मित सोनेजी (आणविक रुधिर विभाग, Lund विश्वविद्यालय) iEP उत्पादन के वर्णन में अपनी भूमिकाओं के लिए धंयवाद । हम यह भी स्वीकार करते है और धंयवाद जूलियन Pulecio (अपक्षयी चिकित्सा के केंद्र, बार्सिलोना जैव चिकित्सा अनुसंधान पार्क), Violeta रेयान-एस्ट्राडा (रॉकफेलर विश्वविद्यालय, ंयूयॉर्क), कार्ल Walkley (सेंट विंसेंट चिकित्सा अनुसंधान संस्थान और चिकित्सा विभाग, सेंट विंसेंट अस्पताल, मेलबोर्न विश्वविद्यालय), Ángel राया (कातालान अनुसंधान और उंनत अध्ययन, बार्सिलोना के लिए संस्था), और विजय जी शंकरन (व्यापक प्रौद्योगिकी और हार्वर्ड, कैंब्रिज के मैसाचुसेट्स इंस्टीट्यूट के संस्थान ) इस काम के लिए उनके पिछले योगदान के लिए । यह काम राग् Söderberg फाउंडेशन (J.F.) द्वारा समर्थित था; स्वीडिश अनुसंधान परिषद (J.F. के लिए); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (to J.F.); सामरिक अनुसंधान के लिए स्वीडिश फाउंडेशन (J.F. के लिए); Åke Wiberg की बुनियाद (to J.F.); एक मैरी क्यूरी एकीकरण अनुदान (J.F. करने के लिए) ।
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
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