Direkte avstamning omprogrammering av voksen mus Fibroblast å Erythroid Progenitors
Summary
Her presenterer vi våre protokollen for produsere indusert erythroid progenitors (iEPs) fra musen voksen fibroblaster med transkripsjon faktor-drevet direkte avstamning omprogrammering (DLR).
Abstract
Erythroid celle engasjement og differensiering fortsette gjennom aktivering av avstamning begrenset transcriptional nettverk orkestrert av en gruppe celle skjebnen bestemme og modning faktorer. Vi tidligere satt ut for å definere et minimumssett med faktorene på krevd for instruere røde blodlegemer utvikling med direkte avstamning omprogrammering av fibroblaster til indusert erythroid progenitors/prekursorer (iEPs). Vi viste at overuttrykte Gata1, Tal1, Lmo2og c-Myc (GTLM) kan raskt konvertere murine og menneskelig fibroblaster direkte til iEPs som ligner bona fide erythroid celler i morfologi, fenotype, og genuttrykk. Ønsker vi at iEPs vil gi et uvurderlig verktøy for å studere erythropoiesis og celle skjebne regulering. Her beskriver vi gradvis prosessen med å konvertere murine hale tips fibroblaster til iEPs via transkripsjon faktor-drevet direkte avstamning omprogrammering (DLR). I dette eksemplet utfører vi omprogrammere i fibroblaster fra erythroid avstamning-sporing mus som uttrykker gule fluorescerende protein (YFP) under kontroll av erytropoietin reseptor genet (EpoR) selskapet, aktivere visualisering av erythroid celle skjebne induksjon på reprogramming. Etter denne protokollen, fibroblaster kan omprogrammeres til iEPs innen fem til åtte dager.
Mens forbedringer kan fortsatt gjøres til prosessen, viser vi at GTLM-mediert omprogrammering er en rask og direkte prosess, gir celler med egenskapene for bona fide erythroid stamfar og forløper celler.
Introduction
Røde blodlegemer (RBCs) er viktig i Alle virveldyr og utgjør 84% av alle celler i menneskelige organer1. Fra embryonale til voksne liv er vår helse svært avhengig av nøyaktig regulering av RBC homeostase. Kontinuerlig produksjon av modne RBCs gjennom utvikling i voksen alder er kjent som erythropoiesis. En stor utfordring i erythropoiesis forskning er å definere master regulatorer som arrangerer RBC utvikling og Bytt mellom primitive og endelig erythropoiesis. Direkte avstamning omprogrammering av erythroid progenitors gir en mulighet til videre forstå erythroid utvikling i vivo.
Direkte avstamning omprogrammering (DLR), også kjent som transdifferentiation, er prosessen med reprogramming en celle type direkte til en annen, omgåelsen pluripotent og multipotent stamfar stadier. DLR har så langt blitt brukt til å produsere mange celletyper inkludert nevrale2, blodkreft3,4,5, hepatic6 og nephrotic7, stamfar celler. For utviklingsmessige biologer, har DLR blitt et viktig verktøy for avhør aspekter av slekten engasjement og terminal differensiering prosesser8,9. DLR kan utfylle og delvis erstatte i vivo studier for forståelse mekanismer for cellen skjebnen bestemme faktorer under utvikling. DLR protokollen omprogrammere til erythroid progenitors beskrevet i dette dokumentet inneholder feltet en gratis metode for utviklingsmessige studier av erythropoiesis.
Vi har tidligere vist at overuttrykte en fire-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, og c-MYC (GTLM), er tilstrekkelig til å omprogrammere både murine og menneskelig fibroblaster direkte til indusert erythroid progenitors (iEPs) 10. den GTLM-omprogrammeres erythroid celler ligner sterkt bona fide primitive erythroid progenitors i morfologi, fenotype og gene expression10. Dermed iEPs har begrenset spredning kapasitet og modne til kjerne erytrocytter lik de transiently produsert i tidlig embryo før utbruddet av endelig erythropoiesis. Ved å gjøre endringer i reprogramming forhold (f.eks punkt mutasjoner i omprogrammering faktorer eller tillegg av andre faktorer), kan man forstå hvordan dette fører til endringer i erythroid utvikling og differensiering. Vi har for eksempel vist at tillegg av Klf1 eller Myb til GTLM cocktail endres globin uttrykk mønsteret fra hovedsakelig embryonale (primitive) til hovedsakelig voksen (endelig). Dette funnet bekrefter gyldigheten av å bruke DLR som et verktøy for å definere utviklingsmessige faktorer i erythropoiesis.
Her skissere vi prosessen med å generere iEPs fra musen halen tips fibroblaster (TTF). I vår representant resultater, vi utført omprogrammering på fibroblaster fra erythroid avstamning-sporing mus (Epor– grobunn R26– eYFP) som express gule fluorescerende protein (eYFP) fra Rosa26 locus i alle celler som uttrykt erytropoietin reseptoren, tillater lett visualisering av forpliktelse til den erythroid avstamning. Bruker denne metoden, finnes YFP positive (EpoR +) celler allerede fem dager etter signaltransduksjon. Denne protokollen, derfor gir en rask og robust teknikk for generering av erythroid progenitors i vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Overuttrykte en fire-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, og c-MYC (GTLM), er nok å omprogrammere murine og menneskelig fibroblaster direkte til iEPs10. Omprogrammeres erythroid cellene sterkt lignet bona fide erythroid progenitors morfologi, fenotype, genuttrykk og colony-forming evne. Dette funnet bekrefter begrunnelsen av benytter direkte omprogrammering som et verktøy for å defin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Evelyn Wang og Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) for kloning og Harvey Lodish (Whitehead Institute) for å gi mange av plasmider brukes til å generere retroviral biblioteket. Vi takker Kavitha Siva og Sofie Singbrant (Institutt for molekylær medisin og Gene Therapy, Lund universitet), Göran Karlsson og Shamit Soneji (Institutt for molekylær hematologi, Lund universitet) for sine roller i Beskrivelse av IOP produksjon. Vi ønsker også å erkjenne og takke Julian Pulecio (sentrum av regenerativ medisin, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent’s Institute for Medical Research og Institutt for medisin, St. Vincent sykehuset, University of Melbourne), Ángel Raya (katalansk institusjon for forskning og studier, Barcelona) og Vijay G. Sankaran (bred Institute av Massachusetts Institute of Technology og Harvard, Cambridge ) for sine tidligere bidrag til dette arbeidet. Dette arbeidet ble støttet av Ragnar Söderberg Foundation (til J.F.); Svenske Forskningsrådet (til J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (å J.F.); Svenske stiftelsen til strategisk forskning (til J.F.); Åke Wiberg Foundation (til J.F.); Marie Curie integrering stipend (til J.F.).
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
