Direkt härstamning omprogrammering av vuxen mus Fibroblast till erytroid stamfäder
Summary
Här presenterar vi våra protokoll för producera inducerad erytroid stamfäder (iEPs) från mus vuxen fibroblaster med transkription faktorn-driven direkt härstamning omprogrammering (DLR).
Abstract
Erytroid cell engagemang och differentiering vidare genom aktivering av ett härstamning-begränsad transkriptionell nätverk iscensatt av en grupp av cell ödet avgöra och mognar faktorer. Vi tidigare anges för att definiera en minimal uppsättning faktorer som behövs för att instruera röda blodkroppar utveckling med hjälp av direkt härstamning omprogrammering av fibroblaster till inducerad erytroid föräldraparets/prekursorer (iEPs). Vi visade att överuttryck av Gata1, Tal1, Lmo2och c-Myc (GTLM) kan snabbt konvertera murina och mänskliga fibroblaster direkt till iEPs som liknar bona fide erytroid celler i form av morfologi, fenotyp, och genuttryck. Vi har för avsikt att iEPs kommer att ge ett ovärderligt verktyg för att studera erytropoesen och cell öde förordning. Här beskriver vi de stegvis processen att omvandla murina tail tip fibroblaster till iEPs via transkription faktorn-driven direkt härstamning omprogrammering (DLR). I det här exemplet utför vi omprogrammering i fibroblaster från erytroid härstamning-tracing möss som uttrycker det gula fluorescerande proteinet (YFP) under kontroll av erytropoietin receptorn gen (EpoR) arrangören, för visualisering av erytroid cell öde induktion vid omprogrammering. Efter detta protokoll, fibroblaster kan omprogrammeras till iEPs inom fem till åtta dagar.
Medan processen kan fortfarande förbättras, visar vi att GTLM-medierad omprogrammering är en snabb och direkt process, ger celler med egenskaperna för bona fide erytroid stamceller och föregångare celler.
Introduction
Röda blodkroppar (RBC) är viktiga i alla ryggradsdjur och 84% av alla celler av mänskliga kroppar1. Från embryonala till vuxna liv är vår hälsa starkt beroende av exakt reglering av RBC homeostas. Pågående produktion av mogna röda blodkroppar under utveckling i vuxenlivet kallas erytropoes. En stor utmaning i erytropoesen forskning är att definiera ledar tillsynsmyndigheterna som dirigera RBC utveckling och växla mellan primitiva och slutgiltiga erytropoes. Direkt härstamning omprogrammering av erytroid föräldraparets utgör en möjlighet att ytterligare förstå erytroid utveckling i vivo.
Direkt härstamning omprogrammering (DLR), även känd som transdifferentiation, är processen att omprogrammera en celltyp direkt in i another, förbi pluripotenta och multipotenta stamceller stadier. DLR har hittills använts för att producera många celltyper inklusive neurala2, hematopoetiska3,4,5, nedsatt6 och nefrotiskt7, stamceller. För utvecklingstoxicitet biologer, har DLR blivit ett viktigt verktyg för förhör aspekter av härstamning engagemang och terminal differentiering processer8,9. DLR kan komplettera och delvis ersätta i vivo studier för förståelse mekanismer i cellen öde avgörande faktorer under utveckling. DLR protokollet för omprogrammering till erytroid stamfäder som beskrivs i detta dokument ger fältet en gratis metod för utvecklande studier av erytropoes.
Vi har tidigare visat att överuttryck av en fyra-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, och c-MYC (GTLM), räcker att programmera både murina och mänskliga fibroblaster direkt till inducerad erytroid stamfäder (individuella) 10. the GTLM-omprogrammeras erytroid celler kraftigt likna bona fide primitiva erytroid föräldraparets vad gäller morfologi, fenotyp och gene expression10. Således iEPs har begränsad spridning kapacitet och mogna till kärnförsedda erytrocyter liknar de övergående produceras i det tidiga embryot innan uppkomsten av slutgiltiga erytropoes. Genom att göra ändringar i omplanering förhållanden (t.ex. punktmutationer i omprogrammering faktorer eller tillägg av andra faktorer), kan man förstå hur detta leder till förändringar i erytroid utveckling och differentiering. Vi har till exempel visat att tillägg av Klf1 eller Myb till GTLM cocktail ändras mönstret globin uttryck från huvudsakligen embryonala (primitiva) främst vuxna (slutgiltiga). Detta konstaterande bekräftar giltigheten av använda DLR som ett verktyg för att definiera utvecklingsmässiga faktorer i erytropoesen.
Här beskriver vi processen att skapa iEPs från mus tail tip fibroblaster (TTF). I våra representativa resultat, vi utfört omprogrammering på fibroblaster från erytroid härstamning-tracing möss (Epor– Cre R26– eYFP) som uttryckligt det gula fluorescerande proteinet (eYFP) från det Rosa26 locus i alla celler som har uttryckt erytropoietin receptorn, möjliggör enkel visualisering av åtagande att erytroid härstamning. Med den här metoden är positiv YFP (EpoR +) celler närvarande så tidigt som fem dagar efter transduktion. Detta protokoll, därför erbjuder en snabb och robust teknik för generering av erytroid stamfäder i vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Överuttryck av en fyra-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, och c-MYC (GTLM), räcker att omprogrammera murina och mänskliga fibroblaster direkt till iEPs10. Omprogrammerade erytroid cellerna liknade kraftigt bona fide erytroid föräldraparets vad gäller morfologi, fenotyp, genuttryck och kolonibildande förmåga. Detta konstaterande bekräftar den logiska grunden för att använda …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Evelyn Wang och Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) för kloning och Harvey Lodish (Whitehead Institute) för att ge många av plasmidsna används för att generera retrovirala biblioteket. Vi tackar Lillemor Siva och Sofie Singbrant (Institutionen för molekylärmedicin och Gene Therapy, Lunds universitet), Göran Karlsson och Shamit Soneji (Institutionen för molekylär hematologi, Lunds universitet) för sina roller i Beskrivning av iEP produktion. Vi vill också erkänna och tacka Julian Pulecio (centrum för regenerativ medicin, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent’s Institutet för medicinsk forskning och Institutionen för medicin, St Vincent’s Hospital, University of Melbourne), Ángel Raya (katalanska institutionen för forskning och avancerade studier, Barcelona) och Vijay G. Sankaran (Broad Institute i Massachusetts Institute of Technology och Harvard, Cambridge ) för deras tidigare bidrag till detta arbete. Detta arbete stöds av Ragnar Söderbergs stiftelse (till J.F.); Vetenskapsrådet (till J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (till J.F.); Stiftelsen för strategisk forskning (till J.F.); Åke Wibergs stiftelse (till J.F.); Marie Curie integration bidrag (till J.F.).
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
