Diriger la lignée reprogrammation de fibroblastes de souris adulte de progéniteurs érythroïdes
Summary
Nous présentons notre protocole pour produire induit progéniteurs érythroïdes (PFE) de fibroblastes adultes de souris à l’aide axée sur le facteur de transcription directement lignée reprogrammation (DLR).
Abstract
Différenciation et l’engagement de cellules érythroïdes procèdent grâce à l’activation d’un réseau transcriptionnel restreints lignée orchestrée par un groupe du sort de la cellule déterminant et facteurs de maturation. Nous avons précédemment énoncés pour définir l’ensemble minimal des facteurs nécessaires pour instruire les globules rouges de développement à l’aide de lignée directe reprogrammation des fibroblastes en progéniteurs/précurseurs érythroïdes induite (PFE). Nous avons montré que la surexpression de Gata1, Tal1 Lmo2et c-Myc (GTLM) peuvent rapidement convertir murins et humains fibroblastes directement aux PFE qui ressemblent à des cellules érythroïdes bona fide en termes de morphologie, phénotype, et l’expression des gènes. Nous avons l’intention que les PEI fournira un outil précieux pour étudier l’érythropoïèse et cellule de régulation sort. Nous décrivons ici le processus progressif de transformer les fibroblastes pointe queue murine PEI via transcription axés sur le facteur lignée directe reprogrammation (DLR). Dans cet exemple, nous effectuons la reprogrammation dans les fibroblastes de souris de traçage lignée érythroïde qui expriment la protéine fluorescente jaune (YFP) sous le contrôle du promoteur du gène (EpoR) érythropoïétine récepteur, permettant la visualisation des cellules érythroïdes induction de sort à la reprogrammation. Suite à ce protocole, les fibroblastes peuvent être reprogrammées en PEI dans les cinq à huit jours.
Tandis que les améliorations peuvent encore être apportées au processus, nous montrons qu’induite par le GTLM reprogrammation est un processus rapid et direct, ce qui donne des cellules avec des propriétés de bona fide cellules progénitrices et précurseurs érythroïdes.
Introduction
Globules rouges (hématies) sont essentiels chez tous les vertébrés et représentent 84 % de toutes les cellules du corps humain1. D’embryonnaire à l’âge adulte, notre santé est fortement tributaire de réglage exact de l’homéostasie de la RBC. La production continue des hématies matures au cours du développement à l’âge adulte est connue comme l’érythropoïèse. Un défi majeur dans la recherche de l’érythropoïèse est de définir les régulateurs maîtres qu’orchestrent le développement de RBC et le commutateur entre érythropoïèse primitive et définitive. Reprogrammation de la lignée directe des progéniteurs érythroïdes présente une opportunité de mieux comprendre érythroïdes développement in vivo.
Lignée directe reprogrammation (DLR), aussi appelé transdifférenciation, est le processus de reprogrammation d’un type de cellule directement dans une autre, contournant pluripotentes et stades de souches multipotentes. DLR a jusqu’à présent été utilisé pour produire de nombreux types de cellules, y compris les neurones2, hématopoïétiques3,4,5, hépatique6 et néphrotique7, cellules progénitrices. Pour les biologistes du développement, DLR est devenu un outil important pour les aspects interrogation d’engagement de la lignée et les processus de différenciation terminale8,9. DLR peut compléter et remplacer partiellement les études in vivo pour la compréhension des mécanismes du destin cellulaire durant le développement des facteurs déterminants. Le protocole DLR de reprogrammation de progéniteurs érythroïdes décrites dans le présent document fournit le champ une méthode gratuite pour les études sur le développement de l’érythropoïèse.
Nous avons démontré précédemment que la surexpression d’un cocktail de quatre facteurs, GATA1, TAL1, LMO2 et c-MYC (GTLM), est suffisante pour reprogrammer les fibroblastes murins et humains directement aux progéniteurs érythroïdes induite (PFE) 10. les cellules érythroïdes le GTLM-reprogrammé grandement ressemblent à des progéniteurs érythroïdes primitives bona fide en termes de morphologie, phénotype et gene expression10. Ainsi les PEI ont limité la capacité de prolifération et mature aux érythrocytes nucléés semblables à ceux produits transitoirement dans l’embryon précoce avant l’apparition de l’érythropoïèse définitif. Par des changements dans les conditions de reprogrammation (p. ex., les mutations ponctuelles dans la reprogrammation des facteurs ou l’ajout d’autres facteurs), on peut comprendre comment ceci mène aux changements érythroïdes développement et différenciation. Nous avons montré par exemple qu’Ajout de Klf1 ou Myb au cocktail GTLM passe au modèle d’expression globine de principalement embryonnaire (primitive) à principalement adulte (définitif). Cette constatation confirme la validité de l’utilisation de DLR comme un outil pour définir les facteurs du développement de l’érythropoïèse.
Ici, nous décrivons le processus de génération de PFE de fibroblastes de souris queue astuce (TTF). Dans nos résultats représentatifs, nous avons effectué la reprogrammation sur les fibroblastes des souris de lignée-traçage érythroïdes (Epor– Cre R26– eYFP) qui expriment la protéine fluorescente jaune (eYFP) du locus Rosa26 dans toutes les cellules qui ont exprimé le récepteur de l’érythropoïétine, ce qui permet de faciliter la visualisation de l’engagement à la lignée érythroïde. En utilisant cette méthode, les cellules positives (EpoR +) YFP sont présents dès que cinq jours après la transduction. Ce protocole, par conséquent, propose une technique rapide et robuste pour la génération de progéniteurs érythroïdes in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
La surexpression d’un cocktail de quatre facteurs, GATA1, TAL1, LMO2 et c-MYC (GTLM), est suffisante pour reprogrammer les fibroblastes murins et humains directement aux PFÉ10. Les cellules érythroïdes reprogrammé ressemblait beaucoup aux progéniteurs érythroïdes bona fide en ce qui concerne la morphologie, phénotype, expression génique et capacité de formatrices. Cette con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Evelyn Wang et Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge (Massachusetts) pour le clonage et Harvey Lodish (Whitehead Institute) fournissant plusieurs des plasmides utilisés pour générer la bibliothèque rétrovirale. Nous remercions Kavitha Siva et Sofie Singbrant (département de médecine moléculaire et Gene Therapy, Université de Lund), Göran Karlsson et Shamit Soneji (département d’hématologie moléculaire, Université de Lund) pour leur rôle dans la description de la production de l’iEP. Nous tenons également à remercier Julian Pulecio (Centre de la médecine régénératrice, Barcelone Biomedical Research Park), Violeta rayonne-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (Institut de recherche médicale de St. Vincent et Département de médecine, hôpital St Vincent, Université de Melbourne), Ángel Raya (Institution catalane pour la recherche et des études supérieures, Barcelone) et Vijay G. Sankaran (Broad Institute de la Massachusetts Institute of Technology et Harvard, Cambridge ) pour leurs contributions antérieures à ce travail. Ce travail a été soutenu par la fondation de Söderberg de Ragnar (à J.F.) ; les Suédois Research Council (à J.F.) ; Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (à J.F.) ; la fondation suédoise pour la recherche stratégique (à J.F.) ; Fondation de Åke Wiberg (à J.F.) ; une subvention de l’intégration de Marie Curie (à J.F.).
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
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