利用病毒衍生系统在大肠杆菌中大规模生产圆形脚手架上的重组 rna
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 通过共同表达一个嵌合 rna, 其中包含对病毒性支架和植物 trna 连接酶感兴趣的 rna, 在大肠杆菌中产生大量的重组 rna。主要产品是一个圆形分子, 有利于纯化到均匀性。
Abstract
随着人们对 rna 生物学的兴趣越来越大, 以及 rna 分子在复杂的生物技术应用中的应用, 产生大量重组 rna 的方法是有限的。在这里, 我们描述了一种在大肠杆菌中产生大量重组 rna 的协议, 该协议基于嵌合分子的共表达, 其中含有病毒性支架和植物 trna 连接酶中感兴趣的 rna。病毒是相对较小的, 非编码, 高度基成的圆形 rna, 具有传染性较高的植物。宿主植物 trna 连接酶是一种由属于avsunviroidae 家族的病毒体 (如茄子潜伏性病毒体 (elvd)) 所吸收的酶, 用于在病毒复制过程中介导 rna 循环。虽然 elvd 不在大肠杆菌中复制, 但 elvd 前体被大肠杆菌rna 聚合酶有效转录, 并由细菌细胞中嵌入的锤头核酶进行处理, 由此产生的单体由共表达的 trna 连接酶达到显著浓度。将感兴趣的 rna 插入 elvd 支架, 可在常规实验室条件下每升细菌培养产生数十毫克的重组 rna。rna 产物的一个主要部分是圆形的, 这一特性有助于将重组 rna 纯化到虚拟同质性。在该协议中 , 与感兴趣的 rna 相对应的互补 dna ( cdna ) 入到 elvd cdna 的特定位置 , 在表达质粒中被用来 , 沿着质粒共同表达茄子 trna 连接酶 , 来转化大肠杆菌。在强本构启动子的控制下, 这两种分子的共表达导致大量重组 rna 的产生。重组 rna 可以从细菌细胞中提取, 并利用其循环性从大量细菌 rna 中分离出来。
Introduction
与 dna 和蛋白质相比, 用于轻松、高效且经济高效地生产大量 rna 的协议并不丰富。然而, 研究和工业对这些生物分子的需求越来越大, 以研究其独特的生物特性1, 或用于复杂的生物技术应用, 包括将其用作高度特异性的2、治疗剂3种, 或选择性农药4种。体外转录和化学合成是研究的常用, 以产生 rna。然而, 当需要大量产品时, 这些方法会带来重要的限制。合理的选择是使用活细胞的内源性转录机制, 然后是一个纯化过程, 将感兴趣的 rna 与细胞同伴分开。根据这一策略, 已经开发出在细菌细胞中产生重组 rna 的方法, 如实验室友好的大肠杆菌5或海洋紫色光养的α-α-天菌6. 在细菌中产生重组 rRNA 的大多数方法依赖于本地高度稳定的 rRNA 支架的表达, 如 rrna 或 rrna, 其中插入了感兴趣的 rRNA 7。这就要求有必要释放嵌合分子感兴趣的 rna, 如果额外的 rna 的存在是下游应用的一个问题8。重组 rna 生物技术的另一个概念是生产重组核糖核酸蛋白复合物, 这些复合物本身可能是所需的产物,也可能被用作保护策略, 以提高感兴趣的 rna 的稳定性9, 10个。同样, 还建议将生产圆形区域协定作为生产更稳定产品的战略 11。
我们最近开发了一种新的方法来产生大肠杆菌中的大量重组 rna , 该方法参与了上述三个概念: 将感兴趣的 rna 插入一个高度稳定的圆形 rna 支架, 以及重组 rna 与相互作用的蛋白质, 很可能产生一个稳定的核糖核酸蛋白复合物, 积累在显着的数量在细菌细胞12。与之前的发展不同的是, 我们使用了一个与大肠杆菌完全陌生的 rna 支架, 即病毒。病毒是一种非常特殊类型的高等植物的传染因子, 完全由相对较小 (246-401 nt) 高度基对圆形 rna13组成。有趣的是, 病毒是非编码的 rna, 在没有自己蛋白质帮助的情况下, 它们能够在受感染的宿主14 中完成复杂的感染周期。这些周期包括 rna-rna 在细胞核或叶绿体中的复制, 这取决于病毒科–分别是松足动物科或阿夫松弧虫科–通过受感染的植物移动和躲避宿主的防御反应。病毒必须被列为自然界中最稳定的 rna 之一, 因为它是一个赤裸的圆形 rna, 必须在植物感染细胞的恶劣环境中生存。这种特性可能使病毒体特别适合作为支架, 在生物技术方法中稳定重组 rna。此外, 新方法还基于病毒性支架与相互作用的植物蛋白的共表达。病毒通过滚动圈机制复制, 在这个机制中, 寄主酶被招募来催化这个过程的不同步骤。值得注意的是, 一些病毒, 更具体地说, 属于avsunviroidae 15家族的病毒体含有也参与复制的核酶。根据病毒种的不同, 病毒性 rna 的转录是由宿主 rna 聚合酶 ii 或氯塑核编码 rna 聚合酶 (nep) 介导的。病毒 rna 的处理似乎是由宿主 iii 型 rnase 催化的, 尽管在具有核酶寡聚 rna 的病毒中, 在复制过程中, 病毒的染色体是自裂的。最后, 所产生的病毒物单体是循环的, 这取决于病毒族, 由宿主 dna 连接酶1或氯乙烯基等形态的 trna 连接酶 16,17。这最后一种酶参与了黄曲霉家族中病毒体单体形式的结扎, 如茄子潜伏性病毒(elvd)18。
在分析茄子 (solanum melongena l.) trna 连接酶识别的 elvd 序列和结构要求的过程中, 我们建立了一个基于大肠杆菌中两种分子共表达的实验系统19. 我们注意到, 在大肠杆菌细胞中, 通过嵌入的锤头核酶有效地自我裂解, 由此产生的病毒性单体具有 5 ‘-羟基和 2 ‘, 3 ‘-磷酸二酯末端。通过共表达的茄子 trna 连接酶有效地循环。更重要的是, 产生的圆形病毒 rna 在大肠杆菌中达到了意想不到的高浓度, 超过了内源性 rnas12。复制中间体的缺乏表明这些细菌细胞中缺乏 elvd rna-rna 扩增。有趣的是, 在病毒分子的特定位置插入异源 rna 对圆形病毒性 rna rna 12 的积累有一定的影响.这些观察使我们设想了一种在细菌中产生大量重组 rna 的方法。在这种方法中 , 与感兴趣的 rna 相对应的 cDNAs 入 elvd cDNAs 中 , 由此产生的嵌合 rna 通过一个强大的本构启动子在大肠杆菌中表达。为了使系统发挥作用,大肠杆菌必须与质粒共同转化, 以表达茄子 trna 连接酶。elv 衍生的比单位长的转录是由嵌入锤头核酶处理的, 所产生的具有适当终点的单体由共同表达的 trna 连接酶识别和循环。这样 , 感兴趣的 rna 入到一个非常稳定的圆形支架组成的病毒性圆形分子。这种重组嵌合 rna 很可能通过与 trna 连接酶的相互作用而形成核糖核酸蛋白复合物, 从而在大肠杆菌细胞内进一步稳定。使用这种方法 (见下面的协议), rna 适配体, 发夹 rna 和其他结构性 rna 已很容易地产生的数量达几十毫克每升大肠杆菌培养在正常的实验室条件下, 并纯化到同质化采取循环12的优点.
Protocol
Representative Results
Discussion
在研究茄子 trna 连接酶识别所涉及的 elvd 序列和结构要求时, 我们注意到, 这两种分子在非宿主大肠杆菌中的共同表达导致了病毒性循环的意外大量积累在细菌细胞19形成。据我们了解,大肠杆菌中病毒性 rna 的大量积累很可能是共同表达高度稳定的 rna 分子的结果, 例如相对较小 (333 nt)、高度基成对的圆形病毒, 以及一种蛋白质。特定的病毒性表现出很高的亲和力。elvd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了西班牙创新大学 ciencia 部长的 BIO2017-83184-r 和 bio2017-91865-exp 赠款的支持。
Materials
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Bpi I | Thermo Scientific | ER1011 | |
| Agarose | Conda | 8010 | D1 low EEO |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086,1000 | |
| Acetic acid | PanReac AppliChem | 131008.1214 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Ethidium bromide | PanReac AppliChem | A1152,0025 | 1% |
| Zymoclean Gel DNA Recovery | Zymo Research | D4001 | |
| NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-3300 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England BioLabs | E2621S | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4003 | |
| Eporator | Eppendorf | 4309000019 | |
| Escherichia coli DH5α | Invitrogen | 18265-017 | |
| Tryptone | Intron Biotechnology | Ba2014 | |
| Yeast extract | Intron Biotechnology | 48045 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | 131659.1211 | |
| Agar | Intron Biotechnology | 25999 | |
| Ampicillin | PanReac AppliChem | A0839,0010 | |
| X-gal | Duchefa | X1402.1000 | |
| N,N-Dimethylformamide | PanReac AppliChem | 131785.1611 | |
| NucloSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 22740588.250 | |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Novagen | 69387-3 | |
| Escherichia coli HT115(DE3) | Ref. Timmons et al., 2001 | ||
| Chloramphenicol | Duchefa | C 0113.0025 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1211 | 87% |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | 131509.1210 | |
| K2HPO4 | PanReac AppliChem | 122333.1211 | |
| HCl | PanReac AppliChem | 131020.1211 | |
| Phenol | Scharlau | FE04791000 | 90% |
| Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,1000 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiTrap DEAE Sepharose FF column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5055-01 | |
| ÄKTAprime plus liquid chromatography system | GE Healthcare Life Sciences | 11001313 | |
| Acrylamyde | PanReac AppliChem | A1089,1000 | 2K |
| N,N’-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279-100G | |
| Urea | PanReac AppliChem | 146392.1211 | |
| Boric acid | PanReac AppliChem | A2940,1000 | |
| Formamide | PanReac AppliChem | A0937,2500 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026-5G | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| N,N′-Bis(acryloyl)cystamine | Sigma-Aldrich | A4929-5G |
References
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